一、范围

本标准规定了实验室对微生物检测方法进行方法确认和方法验证的一般性原则。本标准适用于实验室对非标准方法、实验室制定的方法，超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法的方法确认，以及实验室对新引入标准方法正式使用前的方法验证。

二、方法确认要求

（一）总则

实验室应对非标准方法、实验室制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法的确认制定程序。确认应尽可能全面，以满足预期用途或应用领域的需要。对于确定过的方法，实验室应制定作业指导书。实验室应按照技术方案先进行实验室内确认研究试验，然后，由协作实验室用相同的样品进行实验室间协同试验。可采用对待确认方法与基准方法进行比较研究的方式，对待确认方法的性能参数进行确认。

（二）确认方法的特性参数

实验室可在综合考虑成本、风险和技术可行性基础上，并根据预期的用途来进行方法确认。实验室进行方法确认的内容应完整，包括但不限于以下方法特性：

方法的适用范围；

检测水平和/或定量限；

精密度（重复性和/或再现性）；

正确度；

准确度；

灵敏度；

包容性和排他性；

结果的测量不确定度。

确认方法特性参数的选择

方法确认首先应明确检测对象特定的需求，包括样品的特征，数量等，并应满足客户的特殊需要，同时应根据方法的预期用途，选择需要确认的方法特性参数，典型的需要确认的方法特性参数见表1。

表1 典型方法确认参数的选择

（三）方法特性参数的确认

实验室内方法特性参数的确认

灵敏度

灵敏度是基准方法或待确认方法从含有众多微生物的样本中检测到目标微生物的能力，目的是确定基准方法和待确认方法之间的灵敏度差异。灵敏度试验的样品选择自然和/或人为污染的样品。每个食品种类至少有3种食品类型组成，每个食品类型至少测试20个样品。

比较待确认方法与基准方法的成对结果，两个方法的阳性结果一致则为阳性符合（PA），两个方法阴性结果一致则为阴性符合（NA）。待确认方法检出阳性结果，而基准方法为阴性结果，则为阳性偏离（PD）；待确认方法检出阴性结果，而基准方法为阳性结果，则为阴性偏离（ND）。分别计算待确认方法（SEalt）和基准方法（SEref）的灵敏度，待确认方法的相对正确度（RT）和假阳性率。

其中N是样本总数（NA + PA + PD + ND），FP是假阳性结果。

配对和非配对研究的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之差（ND - PD），配对研究的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之和（ND + PD），用于可接受性限（AL）的评估。方法确认研究的可接受性限（AL）可参考附录A的表A.1。当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法是否不适用于所分析的食品种类或类别。

三、相对检测水平

检测水平（LODx）是预期可以检测到目标微生物的最低含量。在本标准中，使用LOD50，即在一定的污染水平期望获得50%的阳性结果。对待确认方法和基准方法的检测水平（LOD）进行比较研究，并采用相对检测水平（RLOD）对待确认方法进行评估。相对检测水平的研究采用人工污染样品的方式，在三种或更多的污染水平下进行。

RLOD定义为待确认方法和基准法的检测水平（LOD）的比率，计算如式（5）：

配对研究的可接收性限（AL）为1.5，即待确认方法的LOD不得高于参考方法的LOD的1.5倍。未配对研究的AL设定为2.5，即待确认方法的LOD不得高于参考方法的LOD的2.5倍。待确认方法的LOD值小于基准方法的LOD值是可接受的，表明待确认方法比基准方法可能检测到更低的污染水平。

当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认方法是否不适用于所分析的食品种类或类别。

四、包容性和排他性

包容性和排他性所使用的每株菌株应具有足够详细的生物化学和/或血清学和/或遗传学特征。对于定量方法，包容性和排他性测试适用于特定微生物的计数（例如，李斯特氏菌），不适用于计数所有微生物总数的方法，例如菌落总数、霉菌和酵母计数等。对于包容性测试，应测试至少50个（目标）微生物纯培养物。对于排他性测试，应测试至少30个（非目标）微生物的纯培养物。

包容性

只需要使用待确认方法进行包容性测试，在测试过程中不需要添加样品。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。接种水平应比已确认方法的最低检测水平高10倍至100倍。当包容性结果为阴性或可疑时，应同时用基准方法进行重复测试，分析相关菌株是否可以用基准方法进行检测。

排他性

只需要使用待确认方法进行排他性测试，在测试过程中不需要添加样品。测试菌株的纯培养应是最佳生长条件下，非选择性培养基上培养并处于稳定期的细胞群体。如果待确认方法具有在选择性培养基中增菌的步骤，为了排他性测试的目的，选择性培养基应由非选择性培养基替代。当排他性结果为阳性或可疑时，应对待确认方法的完整测试方案进行重复测试，同时用基准方法进行测试，确认基准方法不能够检测出相关菌株。

五、相对正确度

相对正确度研究是对基准方法的结果与待确认方法的结果之间的比较研究。使用自然和/或人工污染样品的方式进行。每个食品种类至少有3种食品类型组成，每个食品类型至少5个代表性样品。所有样品的污染水平应覆盖微生物种类的浓度范围。

使用Bland-Altman方法分析所获得的结果，计算待确认方法和基准方法的平均值和差值，偏倚可以用这两种方法测定结果的差值的平均值D进行估计，平均值D的变异情况则用差值的标准差Sd来描述。如果差值的分布服从正态分布，绝大多数差值都应位于偏差的95％置信区间内。因此，如果两种测量结果的差异位于一致性界限内，是可以接受的。

准确度

准确度研究是通过基准方法的结果与待确认方法的结果之间的比较研究，使用人为工污染样品的方式进行。每个测试的食品类型6个测试样品，其中2个样品低浓度污染水平，2个为中间水平，2个为高浓度污染水平，覆盖所选择的食品类型的整个污染范围。每个测试样品5个重复。

每个测试样品，采用两种方法，在重复条件下进行定量检测。将计数结果转换成对数，如果待确认方法的结果对数值（yi）被假定为符合正态分布，计算yi值的β期望容差区间（β-ETI）。

准确度的可接受性限设置为：AL =±0.5 log10 单位。绘制准确度分布图形。容忍区间的上限和下限通过直线连接，以内插验证样本的不同水平之间的限制行为。水平线表示用基准方法获得的参考值。参考值和待确认方法的每个污染水平的平均值的差用黑点表示。当不存在偏倚时，这些值都位于水平参考线上。此外，可接受性限由两条水平虚线表示，β-ETI限以折线来表示。

对于所有的样本，其β-ETI的上限值≤AL和下限值≥-AL，则认为待确认方法与基准法等效。

六、定量限LOQ

只有待确认方法的测量原理不是基于对目标微生物的菌落进行计数时，才需要确定定量限（LOQ）。例如，采用仪器法测定与微生物生长相关的电导率或荧光等。确定LOQ，需要用待确认方法测试每个食品种类的空白，相同的样品至少测试10个测试单元，结果用于估计基线或阈值的标准偏差S0。通常建议将空白值加上10倍的重复性标准偏差作为LOQ。

七、测量不确定度

对微生物定量分析结果的不确定度产生影响的因素有很多，如质量、体积、样品因素和非样品因素等。其中样品因素，如取样（从大量的待测样品中取出测试样品）是总误差的重要组成部分，但它并不是测量本身不确定度的组成部分，次级取样是指从测试样品（从大量样品中取出的单元）中取出检测的单元。例如，微生物计数中的初始悬液的制备属于次级取样。而非样品因素则为分析过程（包括操作者、时间、设备、培养基和试剂等）。剩余的自由误差的来源于以前未说明的因素，而且往往是在重复性条件下实验室内部进行评定才需考虑的。因此，根据微生物计数的经验，测量不确定度的评估一般不考虑偏倚。

对于微生物定量检测的测量不确定度评估可参考RB/T 151-2016。

八、实验室间方法研究特性参数的确认

定性方法

定性方法实验室间确认研究的目的是确定不同实验室人员使用相同样品（重现性条件）进行测试时，基准方法和待确认方法之间的灵敏度差异。

实验室间研究应至少需要10个协作实验室的10组有效数据。样品应由组织实验室准备，以确保样品之间的均一性。应使用至少三种不同的污染水平：空白对照（L0）和两个水平（L1和L2）。至少有一个水平应获得部分阳性的结果。理论上，1CFU/样品的平均污染水平足以获得部分阳性结果。每个协作实验室需对每个污染水平，采用两种方法，进行8个重复分析，获得至少48个测试结果（8个重复×3个水平×2个方法）。

对于L0污染水平的结果，分别计算参考方法和替代方法的百分比特异性（SP）。

其中，N-为L0污染水平的结果数量；

P0为结果鉴定前空白对照样品获得的假阳性结果的数量；

CP0为空白对照样品获得的假阳性结果的数量。

对于L1和L2污染水平的结果，计算待确认方法的灵敏度（SEalt）和基准方法的灵敏度（SEref），相对正确度（RT）和待确认方法的假阳性率（FPR）。

配对研究中，污染水平L1或L2中至少有一个水平应获得部分的阳性结果，计算该水平的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之差（ND - PD）和阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之和（ND + PD），其其结果值不应高于可接受性限值（ALs）。不同协作实验室数量与可接受性限（ALs）可参考附录A的附表A.2。

非配对研究中，计算获得部分阳性结果的水平（L1或L2）的阴性偏离（ND）和阳性偏离（PD）之差（ND - PD）。（ND-PD）的值不应高于AL。AL值定义为[（ND-PD）max]，其计算可参考ISO 16140-2 5.2.4.2。

定量方法

定量方法实验室间研究的目的是比较不同操作者使用相同样品在再现性条件下确认的待确认方法与基准方法的性能，并将这些结果与基准方法和待确认方法之间的可接受差异的预设标准进行比较。样品应由组织实验室准备，以确保样品之间的均一性。实验室间确证研究应有至少8个实验室的数据，使用两种方法对3个污染水平、每个水平2个重复样品进行分析，得到48对数据（96个结果）。

计算结果的准确度，并绘制准确度分布图形。容忍区间限的上限和下限通过直线连接，以内插验证样本的不同水平之间的限制行为。水平线表示用基准方法获得的参考值。参考值和待确认方法的每个污染水平的平均值的差用黑点表示。当不存在偏倚时，这些值都位于水平参考线上。此外，可接受性限由两条水平虚线表示，β-ETI限为折线来表示。

可接受性限制设置为±0.5log10单位。

对于所有污染水平，β-ETI的值位于可接受限度范围内时，该方法被认为与基准方法相当。

方法验证要求

总则

在微生物检测实验室引入标准方法时，实验室应根据验证操作方法是否满足标准的要求，即证实该方法能在该实验室现有的设施设备、人员、环境条件下获得令人满意的结果，必要时可参加能力验证或进行实验室间比对。

如果只是对标准方法稍加修改，如使用不同制造商的同类设备或试剂等，必要时也应进行验证，以证明能够获得满意的结果，并将其修改内容制订成作业指导文件。

如果发布机构修订了方法，应在所需的程度上重新进行验证。

在进行方法验证之前，应参考标准方法或已确认方法的适用范围，选择用于方法验证的食品种类。

（一）定性方法

估计LOD50

选定用于方法验证的食品种类，每个测试的食品种类需要测定3种接种水平，共8个测试。包括：2个高水平接种，接种量是不超过预期LOD50的十倍。2个中水平接种：将高水平接种物稀释2倍得到中间水平接种物；2个低接种水平：将高水平接种物稀释10倍得到低水平接种物。2个无接种物，作为空白对照。

高水平的接种（10×LOD50）只能获得阳性结果。如果获得阴性结果，则应对所有水平进行重复实验。空白对照不应获得阳性结果，如果获得阳性结果，则应对所有水平进行重复实验。

记录每个接种水平获得的阳性结果的数量，并使用附录B中的表B.1确定估计的LOD50，并与方法确认研究中的LOD50进行比较。如果没有该方法的确认资料，则估计的LOD50应该£3cfu/测试单元。

（二）定量方法

估计偏差

选定用于方法验证的食品种类，定量方法的验证试验尽可能使用自然污染的样品。样品可以来自不同的批次（不同的产品，不同的生产商等），以覆盖方法的测定范围。每个验证的食品种类需要测定3个不同批次，每个批次代表1个污染水平，3个污染水平应涵盖该方法的使用范围。如果样品测试单元的预期自然污染水平低于10 cfu /g，则使用人工污染的方式。

实验室使用基准方法（首选）或实验室当前使用的方法，作为对照方法与待验证方法同步进行试验。如果实验室没有可同步进行的对照方法，实验室应采用非选择性培养基计数培养物的浓度。每个污染水平，待验证方法的计数结果与对照方法结果之间的差值在0.5log cfu / g以内。

精密度

定量分析的精密度仅表现为实验室内重复性。对于在重复性条件下进行的适当的测量数据，可用实验室内重复性标准偏差（SIR）表示。

测试样品尽可能使用自然污染的物品，如果样品测试单元的预期自然污染水平低于10 cfu /g，则使用人工污染的方式。重复性的测定通常需要测定10个以上的测试样品。将每个测试样品均质化并从该均质样品中取出两个测试单元，定义为测试单元A和测试单元B。在验证方法规定的范围内，测试单元A和B的测试条件应尽量不同，应包括但不限于：a）技术人员；b）培养基和试剂；c）仪器（培养箱，涡旋混合器，移液器等）。

实验室内重复性标准偏差（SIR）应小于或等于该方法在确认研究中给出的实验室间再现性标准偏差（SR）。

测量不确定度

如果一个公认测试方法中对不确定度的主要影响因素贡献值和对结果的表达方式有要求，则实验室应该满足于ISO/IEC 17025或同类标准的要求。

附录A

（资料性附录）

定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

定性方法确认中，与样品种类数量相关的配对和不配对研究的可接受性限参数和限值，见表A.1。

表A.1 定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值

注：可接受性限制（AL）基于数据和专家意见。AL不基于数据的统计分析。

实验室间方法确认过程中，与合作实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值，见表A.2。

表A.2 - 与合作实验室数量相关的配对研究的可接受性限参数和限值

附录B

（资料性附录）

根据每个污染水平的阳性结果数量估算LOD50

根据每个污染水平的阳性结果数量估算LOD50见表B.1：

表B.1  根据每个污染水平的阳性结果数量估计LOD50