色谱工作者常会碰到这样的问题，什么时候该换色谱柱了?

塔板数是一个粗略的指标，不能作为评价色谱柱的标准。

通常使用塔板数来考察色谱系统：将新柱子接到仪器上，根据色谱柱生产商提供的测试条件测试该色谱柱，你应该得到和分析报告上同样的结果。最差也应该得到比报告值低10%的塔板数。如果你所测得的塔板数远远低于厂家提供的报告数据，这就说明你的色谱系统可能存在一些问题。进样器、柱外效应、毛细连接以及检测器都是容易出现问题的地方。
 

相信每个色谱工作者都会关心分辨率，分辨率是考察一根色谱柱分离具体样品的好坏程度的指标。色谱的核心任务就是为了使每个峰完成分离，我们在实际工作中需要得到合理峰宽的窄峰以便获得较低的检测限(这已经不是什么难题，现在的色谱柱都可以达到这个要求)。
 

然而，我们需要考虑的另一个因素是塔板数对分辨率的影响仅仅是平方根的关系，这意味着当一根色谱柱的塔板数下降50%，分辨率仅仅下降7%。而当一根色谱柱塔板数下降为新柱子一半的时候，你肯定看到了其它更加严重的症状告诉你这根色谱柱的寿命不长了。其实，大多数用户仅仅使用色谱柱塔板数的一小部分。例如，对一支新的150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱来讲，厂家测试报告上的塔板数为14,000。使用下面的公式可以估算一支色谱柱的塔板数：
 

N=3000*L/Dp
 

L是色谱柱的柱长，以厘米为单位;Dp是填料的粒径，以微米为单位
 

一支150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱的柱效大约为9000，比厂家测试数据低30%。在实际的工作中，大多数色谱方法仅仅需要这些塔板数的一半，这些色谱方法还有优化的空间吗?答案是肯定的。可见，色谱柱的塔板数不是分离中最重要的参数。
 

较好的方法是使用压力、分辨率和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态。压力的测量是最容易的，通常我们确定的色谱方法要满足以下的要求：用新柱子时柱压不高于2500psi，在任何情况下压力都不超过3000psi。尽管现代的液相色谱系统都可在更高的压力下使用，但由于高压产生的系统损耗和泄漏的问题会很严重。当压力超过3000psi时，考虑更换进样器和色谱柱之间的0.5mm孔径的在线滤片。如果更换滤片后压力仍然高，则色谱柱的滤片或者是色谱柱已经被污染，这提示我们该换柱子了。有统计表明，超过60%的色谱柱损坏是由于压力过高的原因。
 

分辨率是我们考察色谱柱的一个非常重要的指标，只要两个组分可以获得基线分离，对该分析物的定量就不会有什么问题。对于对称的高斯峰来讲，1.5的分辨率即可得到基线分离;若Rs在1.7至2.0之间则更好。若峰拖尾严重则需要更高的分辨率。使用分辨率作为色谱柱的评价指标的好处在于我们可以直观地看到相邻的峰的分离情况。
 

另外一个考察色谱柱质量的标准是峰形拖尾情况，厂家测试报告的峰形都非常漂亮，但这并不代表该色谱柱分析实际样品的情况。实际样品中总是含有或多或少引起峰形拖尾的组分。最值得一提的是含有氮原子的化合物，这些化合物和硅胶骨架上的游离硅羟基结合非常紧密，随着色谱柱使用时间越长，键合相流失，拖尾则更加严重。然而拖尾情况的改变不像分辨率的改变那样能够马上看出来。基于此，最好定一个拖尾因子的上限，如美国药典规定拖尾因子不超过1.8。
 

确定色谱柱“抛弃”标准的最佳时间是当我们开发分析方法或作方法认证的时候。通常，在开发分析方法的过程中你会试验几根色谱柱，分析足够多的实际样品，你知道当分离变差的时候是什么样的情况。我倾向于在开始时使用一个宽的范围。我们的经验是这样的：你如果在开始时紧缩系统适用性要求，在方法认证后再放宽这个要求是很困难的。在分析实际样品之前进行系统适用性考察，以确保该色谱方法满足分析者可以接受的标准。

色谱柱使用前的注意事项

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

样品的前处理

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

流动相的配制

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

流动相流速的选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

1．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

2．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

3．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

4．流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

5．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。