质量可控是活性化合物成药及进行药品安全有效性评价的前提。对药品的质量进行控制应该是多方面的,其中包括生产环境的控制、原辅料来源和质量的控制、生产工艺过程的控制,以及按照质量标准进行成品检验控制等。但是,在药品研发过程中,揭示药品的品质、控制药品的质量,通常是要针对研制药品的特性(主药的理化性质及制剂的质量要求等)确定相应的研究测试项目,再根据测试项目的需要,建立适宜的分析方法(包括方法的选择和方法的验证) ,最后是根据药品质量的要求及安全性研究结果确定各测试项目的限度,起草制订检验药品质量的质量标准。

分析方法是揭示药品品质的工具和手段,方法验证是判断采用的分析方法是否科学、可行的过程。实际上,方法验证就是根据确定的检测项目的要求,预先设置一定的验证内容,并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。下面就根据《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》解读分析方法验证的内容和评价要点,在对目前申报资料中分析方法验证工作中存在的问题进行分析的基础上,以高效液相色谱法为例,阐述方法验证的思路及验证要点,希望能对药物研发者有所帮助。

1 方法验证的内容

首先应该明确的是:方法验证的内容应根据检测项目的要求,同时结合所采用的分析方法的特点确定。相同的分析方法用于不同的检测项目时,其验证要求是不同的。例如,采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量检查时的验证要求是不同的;前者重点要验证方法的专属性,而后者重点要验证方法的专属性、准确度和定量限。

通常需要验证的检测项目:鉴别、杂质检查(限度试验、定量试验) 、定量测定(含量测定、溶出度、释放度等) ,还有其他特定的检测项目(粒径分布、分子量分布)等。

方法验证的内容包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性(粗放度)和系统适用性等。

1. 1 专属性

专属性系指在其他成分(如杂质、降解物、辅料等)存在下,采用的分析方法能够正确鉴定、检出被测物的特性。通常,鉴别、杂质检查、含量测定均应验证方法的专属性,排除非主药成分的干扰。

1. 2 线性

线性系指在设计的测定范围内,检测结果与供试品中被测物的浓度(量)直接呈线性关系的程度,是定量测定的基础,涉及定量测定的项目,如杂质定量试验和含量测定均需要验证方法的线性。

1. 3 范围

范围系指能够达到一定的准确度、精密度和线性,测试方法适用的试样中被测物高低限浓度或量的区间。通常用与分析方法的测试结果相同的单位(如百分浓度)表达。涉及到定量测定的检测项目均需要验证范围,如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。

范围应根据剂型和(或)检测项目的要求确定。含量测定范围应为测试浓度的80% ～100%或更宽。制剂的含量均匀度范围应为测试浓度的70%～130%。

1. 4 准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度。

具有一定的准确度是进行定量测定的必要条件,因此,涉及到定量测定的检测项目均需要验证方法的准确度,如含量测定、杂质定量试验等。准确度应在规定的范围内建立。

1. 5 精密度

精密度系指在规定的测试条件下,同一均质供试品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度(离散程度) 。一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度可以从3个层次考察:重复性(同样的操作条件下,在较短时间间隔内,同一分析人员测定结果的精密度) 、中间精密度(同一实验室,不同时间、不同分析人员、不同仪器设备测定结果的精密度) 、重现性(不同实验室、不同分析人员测定结果的精密度,当分析方法被法定标准采用时,应进行重现性试验) 。

1. 6 检测限

检测限系指试样中的被测物能够被检测到的最低量,但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。因此,对杂质限度试验,需验证并证明方法具有足够低的检测限,以保证检出需控制的杂质。

1. 7 定量限

定量限系指试样中的被测物能够被定量测定的最低量,其测定结果应具有一定的准确度和精密度。它体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验,需验证方法的定量限,以保证含量很少的杂质能够被准确测定。

1. 8 耐用性

耐用性系指测定条件发生小的变动时,测定结果不受影响的承受程度。主要考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力。典型的变动因素包括:液相色谱法中流动相的组成、流速和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温等。

1. 9 系统适用性

对一些仪器分析方法,在进行方法验证时,有必要将分析设备、电子仪器与实验操作、测试样品等一起当作完整的系统进行评估。系统适用性便是对整个系统进行评估的指标,其试验参数的设置需根据被验证方法类型而定。

色谱方法对分析设备、电子仪器的依赖程度较高,因此,所有的色谱方法均应进行系统适用性验证,并将该指标作为分析方法的组成部分。

2　方法验证的评价要点及需要关注的问题

2. 1　方法验证的评价要点

方法验证的评价应围绕验证目的进行,同时关注方法验证内容的全面性和试验方案的系统性和合理性,以及验证过程的规范性。

2. 2　方法验证需要关注的问题

2. 2. 1　杂质定量方法验证　

杂质定量试验要验证方法的专属性、检测限、定量限、线性、范围、准确度、精密度等。为考察方法能否有效检出原料药或制剂中的杂质,可采用原料药尚未精制的粗品、或加入合成中间体的方法;还可根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、贮藏条件等选用合适的酸、碱、光、热、氧化等强制破坏性试验来验证方法的专属性;注意进行破坏试验的条件要适度,着重考察敏感条件,即不能无降解产物产生,也不能将主药成分破坏殆尽,应以主药成分破坏20% ～30%为宜;否则,无降解产物产生或主药成分破坏殆尽时进行的专属性试验是不能反映拟定的方法能有效将主药与杂质分开并能有效检出可能的杂质的。另外,在进行方法专属性试验时,还可采用二极管阵列检测器、质谱检测器等检测峰纯度;因在强制降解试验条件下产生的降解产物较药品货架期产生的降解产物复杂、未知杂质多,分离难度大,二极管阵列检测器和质谱检测器可有效显示各色谱峰的纯度,以免因分离度不符合要求,导致分析结果不准确。如果不具备检测峰纯度的试验条件,也可通过调整流动相的组成或比例的方法使各色谱峰的相对保留时间发生改变,来印证杂质检查方法的专属性。

对杂质定量方法验证进行评价,需要关注的问题还有杂质的定量方法。通常,杂质的定量方法有①外标法(杂质对照品法) 。②加校正因子的主成分自身对照法。③不加校正因子的主成分自身对照法。④峰面积归一化法。杂质对照品法定量比较准确,是进行杂质有效控制的最直接的方法,建议已知杂质控制尽量采用杂质对照品法定量;此时,还应对对照品进行评估和确认,制订质量控制要求。加校正因子的主成分自身对照法应对校正因子进行严格测定,该方法适用于相对响应因子在0. 5～1. 5范围内的已知杂质的控制;超出0. 5～1. 5范围时,宜采用杂质对照品法或调整检测波长使杂质的相对响应因子落在0. 5～1. 5范围内。不加校正因子的主成分自身对照法的前提是假定杂质与主成分的响应因子基本相同;相对响应因子在0. 9 ～1. 1 范围内,可以采用主成分自身对照法,超出0. 9～1. 1范围时,宜采用杂质对照品法或加校正因子的主成分自身对照法。峰面积归一化法简便快捷,但是,因各杂质与主成分的响应因子有差异、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围内、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不相同等因素影响定量的准确性,一般不建议采用。

2. 2. 2　复方制剂杂质研究的考虑要点　

复方制剂杂质的来源及种类较单方制剂复杂,其杂质的分离检出、定性及定量研究工作是该类制剂质量控制研究的重点和难点,也是在评价过程中出现问题较多、经常需要以补充资料的形式完善的研究内容。

复方制剂杂质的检查方法应兼顾不同来源的杂质(原料药制备过程引入的杂质、制剂过程和/或贮藏期间的降解产物) ,重点监控稳定性较差药物的降解产物及有毒或有害杂质。

进行复方制剂的杂质研究,首先要分析各杂质的来源,采用适当的方法对杂质进行定性研究和归属。由于主药及其杂质的理化性质的差异可能较大,色谱行为的差异也较大,故一般要采用梯度洗脱或多种色谱条件。在采用紫外检测器时,应选用对各杂质均有较强吸收的波长作为检测波长;当一个测定波长无法兼顾所有杂质时,可选用不同波长分别进行测定。

采用不同的色谱条件分别考察各主药的杂质时,专属性研究既要考察溶剂、辅料是否对被测主药的杂质检测有影响,也要考察其他主药及其杂质是否对该条件下被测主药的杂质检测有影响。在同一色谱条件下同时考察各主药的杂质时,专属性研究应考察溶剂、辅料是否对各杂质检测有影响,各主药峰及各杂质峰是否能有效分离,各杂质是否能明确归属。

复方制剂中的毒性杂质及已知杂质,应采用杂质对照品法进行定量测定。若采用加校正因子的主成分自身对照法,应注意不同时间、不同仪器、不同实验室间相对保留时间的波动,以及当供试品中存在多个杂质而分离度又较差时可能造成的杂质定位的困难。

2. 2. 3　方法再验证　

在某些情况下,如原料药的合成工艺改变、制剂的处方改变、分析方法发生改变等,均需要对分析方法再次进行全面的或部分的验证,以确保分析方法可行,适用于变更后产品的质量控制,这一过程称为方法再验证。进行变更研究和仿制药研制时需特别注意要进行方法再验证工作。

当原料药的合成工艺发生改变时,可能引入新的杂质,杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要重新进行验证,以证明杂质检查方法能够检测新引入的杂质,且新引入的杂质对主成份的含量测定无干扰。

当制剂的处方发生变更时,可能会影响鉴别方法的专属性、溶出度和含量测定的准确度,此时,需要对鉴别、含量测定方法进行再验证。当原料药来源发生变更时,可能会影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度,因此,需要对杂质检查方法和含量测定方法进行再验证。

当某一项目的分析方法发生改变时,如采用高效液相色谱法测定含量的检测波长发生改变,则要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证,同时还应进行方法改变前后所得结果的对比研究,证明变更后的方法合理、可行。

在进行仿制药研究时,其所用原料药的合成工艺、制剂处方中的辅料等可能与已上市药品不同,此时,不仅要对质量标准中部分项目进行方法再验证,还应对根据研制品种质量控制需要增加的测试项目所用的方法进行验证。

3　小结

方法验证是药品质量控制研究重要的组成部分,通常要贯穿药品研发的始终。方法验证应围绕验证目的,根据测试项目的要求,结合所用分析方法的特点确定相应的验证内容;同时要注意验证试验的过程应严谨、规范。另外,随着药品研发的进展及在研发过程中的变更情况进行必要的方法再验证,以不断完善分析方法,同时适用于变更后产品的质量控制。