目前，有三种动物试验可用于化学物质的皮肤致敏测试，包括两种豚鼠试验和一种小鼠试验。其中，最常用的是豚鼠最大限度法(GPMT)和豚鼠局部封闭敷贴法(Buehler test)。

GPMT是最敏感的测试方法，Buehler test是最适合于局部使用产品的测试方法，而小鼠局部淋巴结试验(LLNA)是除豚鼠试验外国际公认的用于测试单一化学物质的测试方法。接下来，本文将从测试原则、测试样本和动物准备、测试过程、测试观察以及结果和讨论这几部分，和大家梳理每种测试的要求。

1.  测试原则 

在实验动物的耳朵背部给与测试样品，并在淋巴结中测量淋巴细胞的增殖程度（除耳朵部位）。若与对照组相比，试验组的细胞增殖反应为三倍及以上，则将该反应定为测试材料为敏化剂的阈值。对于医疗器械产品，可使用未稀释的提取液进行测试。

2.  测试样本和动物准备 

测试样本可以是应用于小鼠耳朵的液体、混悬液、胶体或粘性物质。通常应使用系列浓度进行测试，否则使用最高浓度。常用的提取液是丙酮橄榄油(AOO)4:1的混合物。若是亲水性的且无法粘附于皮肤的液体样本，则可加入羧甲基纤维素或羟乙基纤维素(0.5％w/v)。若是水溶性的化学物质，则可添加二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。

但要注意的是，样本制备过程中使用的任何提取液或添加物，都应该进行验证和记录，证明其不会影响测试结果。

 测试动物应优选健康的CBA/Ca或CBA/J雌性小鼠（非怀孕，8-12周龄），其他选择包括DBA/2、B6C3F1和BALB/c，小鼠应在一周龄波动范围内进行匹配。动物选择和饲养应按照ISO 10993-2标准要求。

3.  测试过程 

对于化学物质，LLNA测试通常以剂量-反应方式进行。对于医疗器械，待测样品因为是提取物，所以常用单剂量测试，而且不进行稀释。但是，当提取物含有高毒性成分时，可能会导致LLNA阴性反应。因此，在研究高毒性提取物时，建议稀释提取物并以剂量-反应方式进行LLNA。

为确保测试再现性和灵敏度，可使用弱至中等接触性过敏原进行测试，如巯基苯并噻唑、己基肉桂醛和苯佐卡因。研究期间应进行动物体重测量及临床观察，并做好记录。

 当进行LLNA测试时，每组通常至少包含4只小鼠；当只有一个剂量可供评估时，每组至少含5只小鼠。淋巴结反应可以通过测量个体或汇集的淋巴结样品来确定。

4.  细胞增殖测定 

淋巴结中的增殖细胞可标记放射性或荧光标记物。常用的放射性标记为3H-甲基胸苷和125I-碘脱氧尿苷，对于荧光可使用氟脱氧尿苷。在LLNA最后一次处理后(72±2)h，记录小鼠体重并静脉注射标记物用于细胞增殖测定。在注射标记物后(5±0.75)h对小鼠实施安乐死，去除引流的耳廓淋巴结。用200μm不锈钢丝网或尼龙网轻轻按压淋巴结来制备单细胞制剂，通过离心将细胞制备物洗涤两次并重悬于PBS中。细胞用5％三氯乙酸(TCA)在(4±2)℃下沉淀(18±1)h。离心后，将沉淀重悬于1ml TCA中，并转移至含有10ml闪烁液的闪烁瓶中进行3H计数，或直接转移至γ计数器进行125I计数。

5.  结果和讨论  

以每小鼠每分钟计数（cpm /小鼠）测量淋巴结细胞中的放射性水平。将每分钟计数(cpm)转换为每分钟衰变(dpm)。计算每组小鼠的cpm或dpm的平均值和标准偏差，从每个结果中减去背景值，并确定刺激指数(SI)。三个及以上测试样本的SI≥3，则被认为是阳性。

1.  样本和动物准备 

测试样本应按照标准附录A进行制备，在不影响测试结果的前提下尽可能使用最高浓度。测试动物应使用体重为300-500克、单一远交系的健康成年白化豚鼠，或是未经产或未怀孕的雌性豚鼠。

试验组豚鼠数量至少为10只，对照组至少为5只。如果存在不明确的反应或不确定结果，则对至少20只测试动物和10只对照动物进行新的研究。动物选择和饲养需满足ISO 10993-2标准要求。

2.  测试过程 

在开展主测试前，应进行初步试验，其目的是确定主试验中的试样浓度。将一系列稀释的测试样品局部应用于动物侧腹（至少三只），24小时后取出封闭敷料和贴剂，并使用下表中给出的分级标准评估应用部位的红斑和水肿。对于主测试中的局部诱导阶段，选择导致轻度至中度红斑的最高浓度；对于主测试中的激发阶段，选择不产生红斑的最高浓度。

• 皮内诱导阶段 

如下图所示，在肩胛内区域，对每只动物进行0.1ml皮内注射。位点A：弗氏完全佐剂与所选溶剂按体积比1:1混合成稳定乳液。位点B：试验样品（未稀释的提取物）；用溶剂注射对照动物。位点C：将位点B使用的浓度的测试样品，与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合成稳定乳液；向对照动物注射空白液体与佐剂的乳液。

• 局部诱导阶段 

在皮内诱导阶段完成后(7±1)天，在每只动物的肩胛内区域，局部使用约8cm2的贴片（滤纸或吸收性纱布）给予测试样品。使用皮内诱导期中选择的浓度用于B点，若达到的最大浓度不产生刺激，则用10％十二烷基硫酸钠按摩皮肤预处理该区域(24±2)h。使用封闭敷料固定贴片，(48±2)h后取下敷料和贴剂。

• 激发阶段 

在局部诱导阶段完成后(14±1)天，通过局部施用将试验样品和空白置于诱导期未处理的部位，例如每只动物的上腹部，使用位点C选择的浓度将贴片浸泡在试验样品中。采用封闭式敷料固定，(24±2)h后取下敷料和贴剂。

3.  动物观察 

在去除敷料后，在全光谱光线下，观察试验组和对照组动物（24±2）h和（48±2）h的激发皮肤部位的外观。并对每个部位和每个时间间隔的进行分级，描述和评定皮肤对红斑和水肿的反应。

4.  结果评估 

如果对照组等级小于1，试验组等级大于等于1则为致敏。如果对照徐等级大于等于1，试验组超过对照组中最严重的反应则为致敏；如果出现疑似反应，应进行再激发已确认首次激发结果。

1.  样本和动物准备 

该部分的要求与“三.1”保持一致。

2.  测试过程 

对于所有局部应用的产品，用测试材料或提取物使适当尺寸的贴剂（滤纸或吸收性纱布）饱和，并将贴剂施加到封闭敷料下的剔除毛发区域(6±0.5)h。在开展主测试前，同样应进行初步试验，使用适当的贴剂将四种浓度的测试样品局部给与动物的侧腹（至少三只）。在(6±0.5)h后取出封闭敷料和贴剂，在贴剂去除后(24±2)h和(48±2)h评估应用部位的红斑和水肿，选择：a）对于诱导阶段，不引起轻微红斑的最高浓度；b）对于激发阶段，不产生红斑最高浓度。

• 诱导阶段 

将贴剂浸泡在一定浓度的测试样品中，施用于每只动物的左上背部区域，在(6±0.5)h后取下，执行此程序的频率为每周三天，并为期三周。同时使用空白液体作为对照。

• 激发阶段 

在最后一次诱导后(14±1)d，用测试样品激发所有测试和对照动物。将贴剂浸泡在一定浓度的测试样品中，通过单次局部施用，将测试样品施用于每只动物的剪切的未测试区域。在（6±0.5）h后取下限制器和封闭敷料和贴剂。

3.  动物观察

在初次或再次激发后(24±2)h，使用表4对测试部位进行分级。在去除激发贴片后(48±2)小时重复分级。在自然光谱或全光谱照明下，观察皮肤反应。

4.  结果评估

如果对照组等级小于1，试验组等级大于等于1则为致敏。如果对照徐等级大于等于1，试验组超过对照组中最严重的反应则为致敏；如果出现疑似反应，应进行再激发已确认首次激发结果。