摘要

本文简述了67/548文件中粒度分布和纤维长度检测方法，并对其适用范围和用途提供了指导。

 

前言

为全面公布67/548/EEC文件中的新药，附录Ⅶ A表明，当某种即将上市的化学药品在暴露过程中存在吸入风险时，需要对其粒度进行检测。

通常，新药申报资料中应包含相应的粒度分布检测方法，因为药物的吸入毒性与粒度分布密切相关。

另一方面，我们需要对对新药和已上市的药物进行风险评估，以判断其形成气体粉尘的可能性，以及气体粉尘的类型（如：含纤维的，不含纤维的）。

迄今为止，67/548/EEC文件中的附录V中未指明检测药品粒度分布的方法。

此外，OECDTG 110中粒度分布检测方法只适用于不溶于水的化合物，而对溶于水的药物并不适用。

本粒度检测指南的初稿形成于Netherlands，并经过EUNational Co-ordinators多次讨论确定了检测方法和主管当局。

综合各成员国专家意见，形成了此检测指南的第三版修订版文件，并在成员国有关67/548/ECC（Ispra，1996年3月24-25日）中科技议题的第二次会议中生成了最终的草案。会议通过在吸入毒性检测方法问世之前，将该草案作为吸入毒性以及其他相应研究的临时参考文件。在51届主管当局会议中通过了科技大会中的决定，并授权执行 67/548/EEC文件。

在此提供本指南文件，以方便有关各方进行磋商和使用。

 

1.引言

通常，依据吸入毒性策略（67/548/EEC文件第七版修正案），以及确定急性毒性作用途径和28天基线研究的必要性，决定了对于粒度检测方法的需求。该研究策略为执行吸入毒性研究提供了重要论点依据。药品通常会含有特定的可吸入的颗粒大小范围（如，可能沉积在呼吸道的任何地方）。吸入粒径的大小范围测定十分重要，因为这影响着药品在呼吸道的沉积区域，以及其是否会形成吸入问题。此外，颗粒粒径分布可以作为支持吸入测试的论据。

因此，用于准确测定粒径分布的方法十分必要。如,在EN481（1993）中，规定使用空气动力学直径作为测量的基础。

空气动力学直径为颗粒的单位密度球体直径，可用于比较不同颗粒的大小、形状以及密度，从而预测该颗粒在呼吸道可能的沉积位置。而反应实际直径的测量直径、光学直径以及几何直径，与颗粒在呼吸道的沉积位置并无直接关联。

EN481(1993)中对沉积颗粒作如下分类：

可吸入颗粒（该颗粒可被鼻子和嘴吸入），实验表明空只有空气气动力学直径＜100μm的颗粒才能被吸入。

可入胸颗粒（该颗粒可进入喉咙），粒径中值为11.64μm，几何标准差是1.5μm。研究表明空气中50%的空气动力学直径为10μm的颗粒，属于胸部沉积组分。

可呼吸颗粒（该颗粒可到达肺泡），粒径中值为4.25μm，几何标准差为1.5μm。研究表明空气中50%的空气动力学直径在4μm的颗粒，属于可呼吸颗粒。

问题是如何将块状药物的粒度分布通过物理测量的方式转化为空气动力学直径，然后转化为可吸入或可呼吸颗粒占有比。可以先将药物处理成气体分散体，然后测量其粒度分布。现有几种商业仪器可以用来测量药物的空气动力学直径（见5）。我们应该注意到仅有滚筒法（见5.3）可以用来区分可吸入、入胸和呼吸颗粒的百分比，而其他仪器仅能测定出可呼吸颗粒的比例。

可呼吸颗粒的存在可能会引发健康问题，因此粒度分布的结果决定着吸入毒性策略，优先选择能够用来确定检测可呼吸颗粒的方法。

第5节所描述的方法能用来测定呼吸性微粒以及可吸入颗粒的分布，其通过计算总气体动力学中位数直径（MMAD）及几何标准差（GSD）以表示颗粒大小。MMAD是一个粒子样本的统计数字，当MMAD值为5μm即表示整个样品颗粒中50%的空气动力学直径大于5μm，50%的空气动力学直径小于5μm。

其它方法（见4）需要间接地通过测定其粒度和密度来计算气动直径。如果运用得当，这些方法可以用来表示颗粒的空气动力特性和质量分数。

我们可以选择使用第5节中的方法来替代第4中方法，通过第5节中的方法确定可呼吸和可吸入颗粒的质量分数，并计算MMAD值，来确定是否存在可吸入风险。

我们应选择适当的取样程序以便制备能准确反应结果的测试样。此外，颗粒的粒度分布还受工艺方法，后续环境以及人工转移的影响。

 

2.确定粒度分布的重要准则

1）目前OECD110中所描述的方法用来确定样品的粒度分布，而不是样品的空气粉尘。因此这些方法并不能提供在处理该化学品时所面临样品暴露的解决措施。此外，这些方法仅适用于水不溶的粉末性产品（＜10-6g/l）。

2）用于确定MMAD的方法，需要用合适的生成设备和正确的采样技术来生成具有代表性的试验大气。由此假设这些方法适用于气载颗粒物（灰尘、烟尘、烟）、喷雾颗粒（湿气溶胶）或者分散粒子（干气溶胶。）

3）用作分析的小样必须能够代表多公斤的不同批次样品。因此，我们要注意避免样品粒径分布发生改变。在样品预处理过程中，我们应尽量避免加入分散剂、搅拌或低频超声处理。

4）我们应特别注意一个事实，就是非导电粒子在非导电液体中可能带电，从而导致某些的不具有代表性的颗粒存在。因此在粒度分布测定过程中，我们一定要考虑到粒子的静电荷。静电粒子的行为不同可能会影响采样过程。

5）样品应做简单的光学显微镜检查，以确定粒子的大概的特性（纤维、感光底片、球体、针状物等）。

6）为了更好的选择检测方法，我们建议预先确定在特定温度下（空隙容积）每个样品中粒子的相对密度，而这可以通过气体离心机实现。通过这种方法，我们可以得到样品处理后在平衡大气中放置时间的影响。

 

3.选择可呼吸/可吸入颗粒物粒度分布的检测方法流程图

本节所描述的方法均在第4节和第5节中提到，而这些方法均可用于测定可呼吸/可吸入颗粒物。本流程中不包括仅可检测可吸入组分而不给出详细分布的方法（见附录）。

 

4.粒度分布的检测方法

显微镜检查、沉淀法和电阻法是常用方法，而激光多普勒风速测量技术使用较少。这些方法能够测定样品的颗粒大小，而不涉及粉尘、分散和雾化的颗粒。因此，不能测定出MMAD值。但是，这些方法能反映出是否存在可呼吸颗粒物。

这些方法目前大多数收载于OECD110指导原则。目前使用的这些技术不适合测定呼吸性颗粒大小（见附录）。

 

4.1显微镜法（见OECD 110）

适用范围：各种粒子

粒径范围：0.5-5000μm（光学显微镜）；0.01-10μm（SEM/TEM）

样品最好直接制备，以免影响颗粒的形状和大小。对于小颗粒（＜0.1μm）建议使用扫描或透射电镜。

结论：该方法适用于测定呼吸颗粒物和可吸入颗粒物的粒径分布但不能测定MMAD值.

 

4.2筛分法（见OECD 110）

适用范围：干燥的粉末/颗粒

粒径范围：100-10000μm（铁丝网筛/金属筛）；5-100μm（微孔筛）

钢丝网筛和多孔板金属筛的筛分范围为100-10000μm，不适用于测定可呼吸和可吸入颗粒的分布。

微孔筛（5-100μm范围内）可能会得到更好的结果。但是，由于这些筛网通常与机械振动或超声波振动联合使用，故可能会导致样品的中位尺寸和形状发生改变。

结论：筛分法不适用于测定可呼吸颗粒物的粒径分布，但可用于测定可吸入颗粒物的粒径分布。同样该法不能测定MMAD值。

 

4.3沉淀法（重力沉降）（见OECD 110;DIN 66115）

适用范围：干燥的粉末/颗粒

粒径范围：2-200μm

该方法完全基于颗粒在液体中的重力沉降，并且可以测定有效的流体动力半径。颗粒在液体中的沉降取决于液体与颗粒物质的比重之差，其中颗粒物质的比重大于液体比重。

OCED 110推荐使用二元或三元混合乳胶球（2-100μm）作为校准物质。但是，目前人们对乳胶球的使用还存有争议，主要在于（a）表面不光滑，（b）直径受湿度的影响较大，（c）在贮存过程中会发生凝结和再聚合。

像OECD110中所提那样，要想获得有效地流体动力半径分布值，我们应该重复测定三次，并且两两结果之间不得差高于20%。此方法粒径范围为＞200μm，2-200μm及＜2μm，并且给出在2-200μm区间的分布曲线。因此不能准确估计出＜10μm（可呼吸颗粒）和＜100μm（可吸入颗粒）颗粒的数量。最佳的粒径范围为：＞100μm，10-100μm及＜10μm，并且对＜10μm的区间作分布曲线。

此外，该方法要求使用大量的半径间隔物质来模拟半径分布曲线。

大量的聚合物粉末在液体中是无法被测量的，因为它们的相对密度会与使用的液体的相对密度太接近而导致沉降时间过久。

该法也可以测定水溶物的粒径分布，使用一种不能溶解样品且不被样品吸附的溶剂，溶剂密度与样品密度不同，以获得合适的沉降时间。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的大小。多数情况下无法测定MMAD值，仅在某些特定情况下能测定MMAD值。

 

4.4电阻法（如库尔特法）（见OECD 110）

适用范围：干燥的粉末/颗粒

粒径范围：1-1000μm

库尔特计数技术测定悬浮在电解液中的样品，当颗粒随电解液通过小孔管时，电导率发生变化，从而测定出颗粒大小。这其中一个重要的参数是颗粒在电解液中的沉降速度，而该沉降速度这取决于颗粒的密度和直径。所以密度不同的颗粒可以通过此法测定。

但是，库尔特计数电阻法仅适用于流体中完全电绝缘体的粒子。此外，颗粒和流体密度差距不能太大。当密度差太大时，我们需要增加流体密度，并在分析前和分析过程中加以搅拌。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的大小。无法测定MMAD值。

 

4.5相位多普勒测速

适用范围：干燥的粉末/颗粒

粒径范围：0.5-80μm（空气中）；0.5μm-mm（液体中）

使用这种昂贵的技术，我们可以测量空气或液体中粒度分布。该方法假定粒子是具有已知折射率的球形。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的粒度。无法测定MMAD值。

 

4.6纤维长度和粒径分布的测定（见OECD 110）

适用范围：纤维物质

粒径范围：0.1-100μm（直径），5-300μm（纤维长度）

纤维是水不溶性颗粒，其长度/直径≥3，其中直径≤100μm。

光镜检查法应用于含纤维的或者能释放纤维的物质，即需要确保样品中纤维的存在，同时应考虑影响纤维形状的杂质。

样品制备过程中必须格外小心，以避免纤维断裂和结块。样品需在罩内或洁净室内处理，避免空气纤维的污染。

样品可以通过以下两种方式制备，（a）在水中缓慢摇晃或涡流混合制备悬浮液。不推荐磁力搅拌，因为这会破坏纤维结构。（b）直接将干燥的样品转移到铜带上或者使用喷雾器或吸液管将干燥纤维喷到铜带上。推荐使用直接转移法直接测量干燥的纤维样品。第一种方法需要将样品进行再次干燥，颗粒的大小和形状会收到影响。喷涂可能导致尺寸差异。

测定样品中的小粒径纤维（≥0.1μm）则需要使用扫描电子显微镜法（SEM）或者转移电子显微镜法（TEM）。

OECD 110指出，颗粒长度和直径分布应至少单独测量两次，至少应计算70根纤维。在给定的直方图中，任何两个值的差值均不应超过50%或3根较大的纤维。如果存在细长的纤维，则需进一步采用更为精确的方法进行测量。

光镜检查法测量长度/直径的比值仅适用于直纤维，测量中应避免弧形和蜷缩的纤维。

结论：该法适用于测量可呼吸和可吸入颗粒中的纤维长度

 

5.气动、分散或雾化粒子的测量

本节中使用的方法需要使用合适的生成设备和正确的采样技术来生成具有代表性的测试大气。这些方法可以测定空气中的颗粒，从而测定颗粒的MMAD值，因此这些方法可作为测定MMAD值的首选方法。喷气筛法不适用于测定可呼吸颗粒的粒径（见附录）。

 

5.1惯性撞击法

适用范围：适用于所有颗粒

粒径范围：0.1-20及0.5-80μm

惯性撞击法可以测量气溶胶/尘雾的粒度分布。空气样品由一个多级装置收集提取。颗粒由于不同的大小和惯性，会被不同级数的收集盘收集。在取样前后对每一级进行称重，从而根据每级的喷射速度计算截止粒径，并计算得出MMAD。尽管该法存在某些局限，如粒子反弹、超载和流量波动等，但该法依然是测量气溶胶粒度分布的较佳方法。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的粒度分布和MMAD值。

 

5.2激光散射法

适用范围：适用于所有颗粒

粒径范围：0.1-100μm

一般来说，入射光经过散射会产生明显的差异，这种差异可以通过检测器读取。颗粒粒径和性质的差异也因此会产生不同的散射和衍射结果。因此，样品检测前需要用与被测样品相似的颗粒（粒径范围一致）来校准仪器。激光散射法适用于球体、立方体和单晶体等几何颗粒。

颗粒大小将通过光学确定，并通过校正计算MMAD值。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的粒度分布和MMAD值。

 

5.3 滚筒法

适用范围：干燥的粉末/颗粒/纤维

粒径范围：0.5-10000μm

这种方法目前还处于实验室研究阶段，在旋转滚筒中反复升降颗粒以产生粉尘云，从而进行大小选择性取样。从滚筒中抽出的空气通过一个特别设计的出口和一个由两个多孔聚氨酯泡沫和一个膜过滤器组成的三级分馏系统。通过重力的方式测定每个收集阶段收集的粉尘质量，从而测定ISO/CEN会议中定义的生物学上可吸入、可入胸和可呼吸组分的粒度分布。

该方法模拟了大量工业过程中颗粒的处理过程，确定了颗粒在空气状态下的生物相关粒度分数。通过对粉尘收集阶段的成分分析，我们可以确定颗粒全粒径分布。

结论：该法可以用于测定可呼吸和可吸入颗粒的粒度分布和MMAD值。

 

6.文献

Fissan,H. and Schwientek,G.(1987).Sampling and transport of aerosols. TSI Journal Particle Intrumentation,2,10p.

Marple, V.A.etal.(1976).Aerodynamic particle size calibration of optical counters. J.AerosolSc. 7,425-433.

Miller, F.J.er al.(1979). Sizeconsiderations for establishing a standard for inhalable particles. J.AirPoll.Contr.Ass.29,610-615.

 

7.附件

本节中所述的这些方法仅适用于测定可吸入颗粒大小，或仅指示可呼吸和可吸入颗粒的存在。

 

7.1 淘析法（见OECD 110）

适用范围：干燥的粉末/颗粒

粒径范围：15-115μm

通过淘析技术，颗粒以不同的速度通过柱子。根据速度计算粒径，根据各速度下淘析出来的样品重量计算粒度分布。

由于粒子需要一定的质量来克服速度力和布朗力，淘析作用仅限于大于15μm的颗粒。

结论：该方法不适用于测定可呼吸颗粒物的粒度分布，但可用于测定可吸入颗粒物的粒度分布。此外该法不能测量MMAD值。

 

7.2空气喷射筛分法

适用范围：所有种类颗粒

粒径范围：10-10000μm

利用空气喷射作为动力推动颗粒通过筛网，实现精密筛分。该方法还能测定样品中的非漂浮部分。

颗粒的聚集将会导致实验误差。此外，由于检测下限仅为10μm，故该方法不适用于测量可呼吸颗粒的粒度分布。

结论：该方法不适用于测定可呼吸颗粒物的粒度分布，但可用于测定可吸入颗粒物的粒度分布。此外该法不能测量MMAD值。

 

7.3 旋风分离法

适用范围：所有种类颗粒

粒径范围：0.1-200μm

旋风分离法是测定试验大气样品中是否存在可呼吸和可吸入颗粒物的一种简单方法。使用旋风分离器，需要获得4.25和100μm的截止点。通过旋风分离器测量颗粒重量，可以确定是否必须采用5.1和5.2中描述的更复杂的方法来确定小于10μm的颗粒的粒度分布。

结论：该方法适用于测定可呼吸和可吸入颗粒物的比例。但无法测定颗粒分别，因此无法确定MMAD值。