药敏试验 稀释法

稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法。根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC），稀释法也可测定最小杀菌浓度（MBC）。

（一）肉汤稀释法 
1、原理　

以水解酪蛋白（M-H）液体培养基将抗菌药作不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制该菌的最低浓度（MIC）或杀死该菌的最低（或最小）杀菌浓度（MBC）。
 

2、材料 

（1） 抗菌药物原液的配制：配制各种抗菌药物原液的溶剂一般为蒸馏水、磷酸盐缓冲液或乙醇等，穰释剂多为蒸馏水。配制时需用标准粉剂并了解其效力（效价），用下列公式计算配制抗菌药物原液一定浓度所需要标准粉剂的毫克数。
A：称取标准粉剂的毫克数
B：稀释剂的毫升数
C：贮存液的浓度（即原液浓度，U／ml或μg／ml）
D：标准粉剂的有效力（即效价，U／mg或μg／mg）

最后，原液以过滤法除菌，小量分装使用。大部分抗菌药物原液在-20℃以下可保存三个月，而在4℃以下只能保存一周。
（2）培养基：一般细菌采用M-H液体培养基；链球菌和嗜血杆菌属除培养基为液体外，其他需补充的成分均同K-B法。
（3）接种菌液的制备：在已分纯的待测菌平板上挑取4～5个形态相同的菌落接种于3～5ml M-H液体培养基内，35℃培养4～6h；链球菌属和嗜血杆菌属的细菌需接种于含血液的M-H液体培养基，35℃培养过夜，校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用M-H液体培养基按1：200稀释后备用。稀释后的菌液应在15min内接种。
 

3、实验步骤
（1）排列试管10～15支，除第一支外，每管加人M-H液体培养基lml。
（2）先吸取抗菌药物原液（1000μg／ml）5.12ml加入液体4.88m1中，混合，吸出分别加入第一管和第二管中，每管1ml，第二管经混合后吸出1ml，加入第三管中，依次类推至第十五管后，吸出1ml弃去，这样各管抗菌药物的最终含量依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03μg／ml。另设培养液对照，检测菌生长对照和质控菌生长对照管各一支。
（3）将已校正浓度的待测菌悬液依次加入含药管内，每管0.05ml，混匀。各试管置35℃培养12～18h后观察结果。每次以同法作对照菌的药敏试验。

4、结果判读： 
最低抑菌浓度（MIC）：凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌MIC。
最低杀菌浓度（MBC）：再以0.01ml容量接种环取肉眼观察认为无菌生长的试管移种一环于血琼脂平板作次代培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9%原始种入的细菌即为该菌的MBC。

第4管为药物最低浓度而肉眼无细菌生长，即待测菌的MIC为16mg/L

6、影响结果的因素：
（1）培养基：培养基的pH、渗透压及电解质对MIC和MBC均有影响。
（2）抗菌药物：抗菌药物必须采用标准粉剂。配好的药物原液应在有效期内使用。
（3）结果观察时间：16～18h观察，有的细菌在20～24h观察。培养时间过长，被轻度抑制的部分细菌可重新开始生长；另外由于某些抗菌药物不够稳定，培养时间过长使其抗菌活性降低，甚至消失，从而使MIC值增高。
 

7、质量控制：每次实验时应根据待测菌的不同而分别选用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在同-试验条件下作平行试验，常用抗菌药物对这些标准菌株的MIC应在预期值范围内。超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告，应检查出现差错的原因以及标准菌株被污染和变异的可能性。
 

8、杀菌试验
临床实验室常用的定量评价抗菌药物杀菌效力的试验主要包括最低杀菌浓度（MBC）试验和杀菌曲线法。
①最低杀菌浓度　最低杀菌浓度是某抗菌药物能杀灭99.9%以上的测试菌量的最低药物浓度。测定方法就是稀释法MIC测定的基础上通过再转种、再孵育，最终测得某种抗菌药物对被测菌的MBC。
②时间-杀菌曲线 时间-杀菌曲线主要用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，以及两种或两种以上抗菌药物对测试菌的联合杀菌活性。操作时培养基和测试菌的准备等与测定MIC的肉汤稀释法相同，设定0h、4h、8h、24h等不同培养时间的试验管，对每个管均设立生长对照管，每个试验管在到达孵育时间后，立即连同生长对照管转种血平板进行菌落计数。最后将各时间点测得的平均菌落计数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线。