01

分析方法 

在清洁验证中选择一个合适的分析方法是非常必要的，该适当的分析方法应能够充分检测相关残留物。理解可以从分析结果中得出什么结论也很重要（例如检测的是产品还是清洁剂，结果是否合格？），检测结果决定了清洁方法是否可行或需要进一步改进。本章讨论的内容是怎样选择一个合适的测试方法，包括适用性、化学和微生物测试方法的信息，以及测试方法的验证。

 

本章的重点不是阐述分析方法的特性和局限性（尽管对此也有一定描述），而是判断获得了什么信息以及何时可采用某一特定分析方法的思考过程。对于清洁工艺的理解是在清洁验证不同阶段选择适当分析方法的关键。

 

02

 分析方法的目的 

 

在一个生命周期的清洁验证方法里，在清洁验证的不同的阶段可能使用不同的分析方法来评价残留物。清洁验证的生命周期包括设计/开发、确认和验证维护。在生命周期中的任一阶段，分析方法也可以作为调查的一部分。考虑和评估希望以及能够从一个特定分析程序中获得什么信息是很重要的。

 

例如，在早期的开发过程中，可能没有残留物的足够的信息（例如活性成分是否降解），而且一个特定的分析方法可能也没有经过验证。然而，在清洁工艺开发时，采用非专属性方法可能有助于较准确地了解清洁工艺的综合效果，即使这种非专属性方法可能是或不是最终清洁验证方案中选定的分析方法。

 

另外一个例子是用于调查的分析方法的选择。在验证（确认）中，通常首选的分析方法应能够适当检测出目标残留物（例如活性成分）是否符合预定的可接受限度。但是，对于一个偏差（不符合）的调查，在特定的条件下（例如在验证方案中使用的是一个非专属性方法），采用一个能够定性检测出该残留物性质（例如，是活性成分、清洁剂还是辅料？）的分析方法则是更为重要的。

 

需要重点强调的是，理解为何选择一个分析方法是建立一个可靠的、科学的和基于风险的清洁验证方法的关键。仅仅因为是过去使用过的分析方法并不一定意味着它可以用于新的应用中。

 

03

 分析方法的实际考虑 

 

在理想的情况下，应选择最好的分析方法；实际上，分析方法的选择可能会受到实际情况的限制。许多情况下，更重要的不是选择的分析方法是最佳的，而是该方法能够满足预期的目的。在选择分析方法时，必须考虑一个特定公司现有的分析方法，例如，如果现有的分析方法能够满足检测目的，公司就不太可能再投入开发另一个新的分析方法。新的方法可能意味着设备采购、人员培训和设备维护投入，相关的费用需与预期的收益进行平衡。例如，直到TOC方法替代了药典方法中的易氧化物检验之后才被广泛应用于清洁验证中，之后制药公司也就很快地熟悉和接受了这项技术。

 

另一方面，如果现在的内控方法不足以满足预期的目的，则需要采用一个新的分析方法，这些工作可以在合同实验室完成或建立新的内控分析方法，可基于商业上的考虑决定建立新的内控分析方法还是由合同实验室完成。

 

04

 验证方案中的专属性和非专属性方法对比 

 

专属性分析方法是指那些在有预期干扰物存在的情况下仍可以检测特定残留物的方法。如果在验证方案中的目标分析物是活性成分，那些干扰物可能包括降解物和有关物质、辅料、清洁剂和清洁工艺副产物。专属性方法包括液相色谱法（包括HPLC、UPLC和TLC）和光谱法（包括紫外、可见和红外），这些方法都需要使用适宜的对照品。相反的，非专属性方法测量的是一种大致的性质，例如电导率和TOC，它可能源于多种分析物和不同来源。

 

分析方法的选择可能取决于清洁工艺后存在的残留物的性质。只有在清洁过程中活性成分没有发生降解（例如，在经过高温和极端的pH之后），使用一个专属性的方法测定该活性成分才有意义；如果已知在清洁工艺中活性成分会发生降解，那么使用专属性方法检测活性成分时，可能就不会检测（测量）到活性成分。在这种情况下，验证方案中就应该考虑使用一个专属性测定降解物或采用一个非专属性方法（例如TOC）测量残留；如果限度是按照活性成分的降解物建立的，也可以考虑采用一个专属性分析方法测定降解物。

 

应该认识到，在验证方案中，使用适宜的非专属性分析方法更能证明清洁方法的耐用性，因为除了目标残留物外其他成分也会有响应，而这种响应将被假设为源于目标残留物（24）。然而，当检测结果超出限度时，使用一个非专属性分析方法无法为失败提供任何信息，偏高的检测结果可能来源于活性成分、辅料、清洁剂和/或这些成分共同作用造成的响应值。

 

本技术报告中的任何内容都不应理解为：一般应优先选择专属性方法而不是非专属性方法。

 

05

 专属性和非专属性方法的法规状况 

 

无论是专属性方法还是非专属性方法，监管部门都是可以接受的。然而，必须要注意不要误用分析方法。例如，如果不知道清洁过程中活性会发生降解，就可能错误地使用专属性方法；如果非专属性响应不完全源自目标残留物，则可能误用非专属性的方法。

 

美国FDA清洁验证指南要求“对于检测残留或污染物的分析方法，应该验证其专属性和灵敏度”（20）。因此有些人认为应使用专属性的分析方法，但更恰当的说法应该是，不管使用哪种类型的分析方法，要确保能够恰当地使用该方法。欧洲PIC/S建议“用于检测残留物或污染物的分析方法对于被分析物应该是专属的”。这再一次被解读为应该使用专属性的分析方法。但是实际并非如此，因为非专属性方法在世界上各公司已经广泛地应用并且被美国FDA和欧洲药监当局所接受。

 

06

 最常用的分析技术 

 

这一节中我们所要讨论的焦点是清洁验证中最常用的分析方法（25）。专家组认为应基于清洁验证的各个阶段所提供的相关信息，选择常用的分析方法。方法的特性、优点和局限性经常因使用的条件而不同，因此本文不再赘述。

 

选择方法还要考虑以下内容：

• 可用的仪器

•  检测的速度

• 检测技术的专属性

•  取样限制（包括取样溶剂）

•  检测限/定量限

• 响应值的线性

• 能否在线检测

• 费用

 

在制药清洁验证最多的应用是在一已验证范围内定量测定残留物的量。然而，在一些特定的情况下，合格-不合格检测，也被称为“放行-不放行”检测，也可用来检测残留物是否在可接受限度之下。这种检测可以用于临床生产的确认批（如果在线性范围内进行全面验证则成本可能较高）或用于例行监测和设备放行（基于最终淋洗液的检测结果）。合格-不合格检测通常不能证明清洁工艺的耐用性，除非合格-不合格点远远低于所需的可接受限度。由于该转换点是一个范围，因此这个范围必须是已知的，并在验证过程中建立该范围与限度之间的关系。实际的结果，尽管是合格的，可能与不合格结果是非常接近的，考虑到结果的正负误差，可能实际上就已经是不合格的结果了。

 

07

液相色谱法（LC） 

 

液相色谱法包括HPLC（高效液相色谱）、UPLC（超高效液相色谱）和TLC（薄层色谱）。所有这些方法都是通过色谱方法先将各组分分离，再测定各分离组分的量。对于HPLC法和UPLC法，通常都是采用紫外（UV）检测器进行的测定，根据待测物也可以选择其他适宜的检测器。

 

HPLC法和UPLC法通常为专属性方法，被广泛应用于小分子生产（包括API和制剂）中活性成分的测定。多数情况下，HPLC法/UPLC法已经被开发成活性成分的含量测定方法，只需要做小的修改即可用于确认时残留物的测定。这些额外的修改包括确认线性范围是否适用于残留物的测定，以及在清洁系统中存在的“预期的干扰物”是否会干扰活性成分的测定。如果活性成分在清洁过程中发生降解，那么HPLC法/UPLC法可能就不适用于测定活性成分的残留，除非该色谱条件可以将降解物分离并测定出来。

 

TLC方法可以应用于小分子化合物清洁的各个阶段。例如，它可以用于设计/开发阶段以确认和定性活性成分的降解情况。TLC方法也可以用于调查（在清洁验证的各个阶段）以定性残留物。

 

08

 紫外/可见分光光度法（UV/Vis 

 

紫外/可见分光光度法是通过在特定波长下测定残留物溶液的透过率/吸收值来进行测定的。它通常要求分子中存在一个生色基团，也可以通过衍生法使残留物产生一个生色基团。例如，紫外/可见分光光度法通常被小分子化合物生产企业特别是API生产企业所采用，它不需要将残留物分离出来进行定量。由于该方法比较简便，因此可以应用于清洁验证的设计/开发、确认和验证维护阶段，以及各种调查中。紫外/可见分光光度法在小分子API生产中也可以作为PAT技术判断清洁步骤的终点。

 

总有机碳（TOC）

TOC法可以用于含有大量有机碳的残留物的检测。TOC法是通过将样品中的碳氧化并测定所生产的二氧化碳的含量来完成的。氧化的方法包括紫外法、过硫酸法和燃烧法，检测产生的二氧化碳的技术包括电导率法、基于膜的电导率法和红外法。在线和离线的TOC都是可行的。

 

对于使用TOC法，目标残留物必须具有足够的水溶性。用于清洁验证的TOC法通常是将所有的检测到的残留物都假设成目标残留物。在生产过程中，如果目标残留物（例如活性成分）在清洁过程中会发生降解，则TOC法是常用的方法。然而，TOC法也可以用于那些活性分成不发生降解的情况，在这种情况下使用TOC法的理由是分析方法易于开发，而且在TOC检测中最差条件的假设是始终存在的。

 

TOC也可以用于清洁验证的各个阶段，包括设计/开发、确认和验证维护，以及调查

电导率

电导率测定是通过测定水溶液样品中解离的离子物质来完成的。在确认方案中，电导率读数表示为微西门子/厘米（μS/cm）；用于清洁溶液的控制和监测时，电导率表示为毫西门子/厘米（mS/cm）。电导率法经常被应用于清洁剂残留（例如碱性或酸性试剂）的检测，以及在自动清洁工艺（例如CIP）中控制清洁剂的浓度。电导率的读数受样品温度的影响很大，样品温度的调整、自动温度补偿以及指定温度的电导率/浓度曲线可以用于测量结果的校正。

 

为了将电导率读数与清洁剂的浓度相关联，应建立特定温度下的稀释曲线（电导率对浓度），这可以通过测定特定温度下接近可接受标准的不同稀释浓度的电导率完成。

 

电导率是一种非专属性的方法，它在一定范围内与样品溶液的离子浓度线性相关。分析仪器耐用，而且接受过相应培训的人员可以在生产车间进行检测。该方法不会区分不同的离子，因此如同TOC一样，所有超过水的基准电导率的结果都是由于污染造成的（例如清洁剂）。

 

电导率通常说明了碱性或酸性清洁剂的存在，测量电导率是一种判定冲洗终点的好方法，因此对于清洁工艺的日常监控，测量电导率也是间接证明清洁效果的好方法。

 

电导也被用于测定离子型活性成分的残留，不管是单独以水为清洁剂，还是使用了离子型清洁剂，只是所有的电导率响应值都应作为活性成分的响应值（即使其中的一些响应值源自清洁剂）。

 

感观评价

“感观”评价包括目视和其他评价，例如嗅觉。目视检查通常在清洁验证的各个阶段都有使用，因为目视洁净是生产设备符合GMP的最低要求。目视检查是一种非专属性方法，除非做进一步分析，一般无法鉴定残留物的性质。

 

需要进行培训并建立一个详细的文件，确保不同人员的“目视清洁”是一致的。目检结果受距离、角度、光线、表面的性质，以及检查人的视力影响会有很大不同。使用光学设备例如镜子、远程光纤视镜或管道镜可有助于目视检查。

 

目视检查程序应当明确检查者怎样处理观察结果。目视检查可以发现四种不同类型结果：残留物、表面异常、异物和水。残留物是主要关注点，当评估清洁行程是否合格时，发现残留物就可能意味着目视检查结果的失败。如果可能的话，应收集样品残留做进一步检测，以协助调查可能的原因。通常，在清洁验证中出现表面异常和异物时，不认为目检结果不合格，但必须进行进一步调查和纠正。应记录表面异常情况，评估“是否适合使用”，并纠正发现的各种问题。红锈在目视检查中是一种最常见的表面异常，它往往被认为是一种预防性维护问题而不是清洁工艺问题。异物及其去除应被记录下来。同样，异物是怎么进入到设备当中也要进行调查。有时应区分无积水（“自排水设备”）和无可视水滴（“干燥设备”），特别是对于积水，应记录观察结果，调查原因，并说明其对目视检查以及贮存过程中的微生物增长的影响。

 

如果可能的话，所有的设备表面被应该进行目检。当无法或不宜拆卸设备时，或者对设备进行目检可能造成人员伤害（如，进入限制性空间）时，可能无法对安装在该设备上的管线和管道内部（尽管可以对出口处进行观察）进行目检。

 

应建立目检培训计划，检查人员应按照要求接受培训和/或进行资格确认。如果对于一些区域无法进行目检，则应确保他取样方法（例如冲洗取样）能够充分地检测出潜在的目标残留物。

 

作为一种感观方法，嗅觉检查通常只用于设备取样时有一种特殊气味，应对此进行调查。

 

09

其他有用的分析技术 

 

以下其他技术可能用于清洁验证的不同阶段。

 pH

pH是一种测量氢离子浓度的技术，它可以作为工艺监测手段，特殊是当设备贮存在防腐溶液中（通常为酸性或碱性）时。pH法也可以用于定性确认是否存在正确的清洁溶液。pH法也可以作为电导率测量的补充，然而在测量碱性或酸性清洁剂残留时，pH法不如比电导率法，因为pH值与氢离子浓度呈对数关系，而电导率与离子浓度是直接线性相关的。此外，也没有必要将电导率与pH值直接关联，特别是对于中性清洁剂。

 

红外光谱法（IR）

红外光谱法包括FTIR（傅立叶变换红外光谱法）和NIR（近红外光谱法）。当调查中需要对可能存在的有机残留进行鉴别时，这些技术最为有用。确认过程中，可采用FTIR联合光纤探头直接测定设备表面残留物的量。

 

光学显微法

光学显微法包括扫描电镜法（SEM），它是一种可以鉴定设备表面污染物的方法。大多情况下，传统的光学显微法和SEM可以与其他分析技术联合使用，例如X-射线衍射、质谱和核磁共振（NMR）。单独的显微技术可以鉴定残留物的物理性质，但不能鉴定其化学结构，显微法的一个实际的应用是用于评估和鉴定一个新的或旧的设备中的未知污染物，这些技术对于在调查中评估残留物是特别有价值的。

 

滴定法

滴定法是另一种简单但经常被人忽视的方法，尽管其在适宜的清洁情况下它可以提供有价值的信息。滴定法可能是专属性（磷酸盐）或非专属性（例如，对于所有的阴离子表面活性剂）方法，本方法可能更多地用于确认过程中碱性或酸性清洁剂的检测。

 

重量分析法

重量分析法可以用于设计/开发和确认中。它多应用于测定小分子API合成过程中的残留物，通过将大量冲洗溶剂或回流溶剂蒸干而测得。

 

酶联免疫分析法（ELISA）

酶联免疫分析法是一种抗原-抗体反应，使用特定的化合物测定残留物。酶联免疫分析法通常局限于生物技术和生物制品生产中，可以用于设计/开发阶段以确认活性成分的降解，以及任何调查中。

 

毛细管区带电泳（CZE）

毛细管区带电泳又被称为毛细管电泳，这项技术是依靠电场里的电荷和摩擦力将残留物进行分离的，通常采用荧光检测器进行检测。CZE主要被应用于生物技术工业中，在设计/开发及确认阶段检测活性成分及其降解物，以及用于调查。

 

原子吸收法（AA）和电感耦合等离子体

这两种技术都可以用于溶液中的金属，这种金属可以是是处方中的一部分或未知残留物（例如疑似红锈）。

离子迁移光谱（IMS）

这项技术是质谱的一种类型，它只提供被分析样本的飞行时间。由于其分析时间较短（几分钟）而被提倡，可以更多地用于日常监测和放行。

 

10

 微生物检验方法

1993年美国FDA清洁验证指南中指出“通过充分地清洁和设备存放以控制生物负载，这对确保随后的灭菌和消毒程序达到必要的无菌保证水平是非常重要的”。PIC/S指南要求“清洁程序的验证内容应包括去除前一产品、清洁剂的残留所带来的污染，以及潜在微生物污染的控制”。因此微生物残留的控制也是清洁验证的一个重要部分。微生物残留包括生物负载和内毒素。通常清洁验证方案中应包含生物负载取样和检测，除非有科学的和基于风险的书面理由表明不需要进行，这可能包括生产上的考虑，例如小分子API生产中所有使用溶剂的工艺、口服制剂生产中使用乙醇进行最终淋洗、清洁之后进行灭菌，和/或有证据表明类似的清洁工艺能够对微生物有充分的控制。

 

内毒素

通常如果下一个产品质量标准中有内毒素检查项的话，应在清洁验证中进行内毒素检测。内毒素分析方法通常是药典方法。验证方案中不进行内毒素检测需要科学的和基于风险的理由，这可包括生产上的考虑，例如小分子API生产中所有的使用溶剂的工艺，有经验证可以减少细菌内毒素的操作步骤，和/或有证据表明类似的清洁工艺能够充分控制内毒素。

 

生物负载

生物负载的检测可以采用淋洗水取样、棉签擦试取样和接触碟取样。淋洗水取样后一般采用薄膜过滤法过滤，再将膜贴在适宜的琼脂培养基上，培养、计数。淋洗水取样检测生物负载的优点是它可以提供设备清洁状况的全景信息。淋洗水生物负载检测通常采用水系统微生物的检测中已确认的方法。淋洗水取样/薄膜过滤检测的最大缺点是没有一个普遍适用的可接受标准。例如，如果取100ml淋洗水用于检测，可接受标准为100CFU/ml，而通常可以计数的菌落数应不超过300，这就要求如果符合计数标准要求的话样品的可接受标准应为3CFU/ml。在大多数情况下这并不是问题，可以通过降低样品的取样体积（或稀释样品）来解决。也可以是采用涂布平板阀或倒平板法进行微生物检验。

 

还有两种可以直接测量表面上生物负载的方法是棉签擦试法和接触碟法。对于棉签擦试法，应将棉签上的菌释放出来，通过涂布法或倾注法进行计数。接触碟法则可直接培养并计数。接触碟法和棉签擦试法最大的问题是可能将产品接触表面与未知培养基或棉签中的缓冲溶液相接触，因此在生产前应确认培养基或缓冲溶液是否已清除。接触碟法的另一个问题是需要设备表面是平整的。

 

大多数公司生物负载检测，需要在适宜的培养基中培养并计数。这种方法的缺点是只能提供菌落数而不是单个细胞数量。由于可能会破坏细胞，取样和检验可能影响报告的计数结果。另外，虽然生物负载报告结果通常小于20CFU，但一般说来计数结果如果低于20CFU，则说明你建立的方法是不科学的。另外一种方法是使用快速仪器法检测微生物，PDA技术报告33《新微生物检验方法的评价、验证和执行》可以作为讨论该快速检验方法的参考。