摘要：目的：对血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）结合活性试验两种结果分析方法进行比较，以考察两者的差异。方法：采用固定剂量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后，检测未结合的VEGF的量，分别以未结合的VEGF量对VEGF Trap浓度梯度和未结合的VEGF检测板的OD值对VEGF Trap浓度梯度进行四参数方程拟合，两种方法计算该产品的结合活性。结果：两种方法均满足试验有效性条件，且血管内皮生长因子抑制剂供试品和标准品的半数抑制浓度（IC50）均分别为3.68和3.6pmoL·L-1，供试品的结合活性为102%。结论：证明了两种分析方法得到的结果完全一致。为同类产品结合活性计算方法的选择提供借鉴。
血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）是具有VEGF阻断作用的重组蛋白，由两种不同的人VEGF受体VEGFR1和VEGFR2的细胞外区域融合到人免疫球蛋白IgG1的Fc部分组成。对VEGF-A、VEGF-B和PlGF等因子有较好的亲和力。血管内皮生长因子抑制剂通过与上述因子的紧密结合，降低血管通透性，进一步抑制新生血管的生成。目前，该产品已经在美国、欧盟、日本及中国上市，主要用于治疗年龄相关性黄斑变性（Age Related Macular Degeneration，AMD）、视网膜静脉阻塞（Retinal Vein Occlusion，RVO）继发黄斑水肿，以及糖尿病黄斑水肿（Diabetic Macular Edema，DME）等[1-4]。
前期已建立了VEGF Trap的质控方法和质控标准用于其质量控制[5-6]。其中结和力是VEGF Trap性能参数中一个重要的指标，是质量控制的关键[7-9]，采用的方法是将固定量的VEGF与系列稀释的VEGF Trap处理之后，再检测未结合的VEGF的量，该法虽增加了预先结合的步骤，但下一步检测时采用商业化的试剂盒，干扰因素少，商业化抗体与被检抗体相互验证，结果更加真实、客观[10-11]。
本研究比较了VEGF Trap结合活性试验中两种结果的分析方法，以考察两者之间的差异，为同类产品结合活性试验结果分析方法的选择提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 试验材料及仪器
VEGF Trap标准品和一个批次的1支VEGF Trap供试品均为本科室留样；重组人VEGF165（货号293-VE）和Quantikine Human VEGF ELISA试剂盒（编号DVE00）均购自美国R&D Systems公司；BSA（编号12659）购自德国默克公司；脱脂奶粉（编号232100）购自美国BD公司；SpectraMax Gemini XS酶标仪及SOFT MAX分析软件为美国Molecular Devices公司产品。
1.2 结合试验酶标板的包被
在96孔酶标板每孔加入300 μL封闭剂（含0.1%BSA和5%脱脂奶粉的PBS溶液），于室温放置至少2 h，使用前用PBS洗涤4次。
1.3 供试品的制备
用稀释液（含0.1% BSA的PBS溶液）将VEGF Trap标准品和VEGF Trap供试品稀释至1 nmoL·L-1（其相对分子质量为97000）；将VEGF165稀释至0.2nmoL·L-1（其相对分子质量为42000），在结合试验中作为固定量的VEGF165；将VEGF165稀释至1 nmoL·L-1，用于绘制标准曲线。另配制320 pmoL·L-1和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液，用于质控。另取一块新的96孔酶标板作为稀释板，在该板中加入用稀释液制备好的1 nmoL·L-1 VEGF Trap供试品和标准品进行2倍系列稀释，共10个稀释度，同时设置空白对照孔，每个供试品做3个重复孔。
1.4 结合板的制备
取包被好的96孔酶标板作为结合板，将稀释好的VEGF Trap供试品和标准品25 μL加至该板的孔中，每孔再加入165 μL稀释液和10 μL的0.2nmoL·L-1的VEGF165溶液。混匀，室温下孵育12~20 h。
1.5 VEGF165标准曲线及质控孔的制备
用稀释液对1 nmoL·L-1的重组人VEGF165进行2倍系列稀释，共7个稀释度，同时设空白对照孔。取稀释好的上述溶液10 μL，加至结合板的孔中，每孔加入190 μL稀释液，用作VEGF165标准曲线制备。在结合板的新孔中再分别加入320和48 pmoL·L-1的VEGF165溶液25 μL，再向各孔中加入175 μL稀释液，制得40和6 pmoL·L-1的VEGF165溶液，作为试验中VEGF165溶液高浓度和低浓度质控孔。混匀，室温下孵育12~20 h。
1.6 游离VEGF165的检测
从结合板中取出100 μ L结合液，加入Quantikine® Human VEGF检测板中，采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书检测结合后游离VEGF165。
1.7 结果分析方法
1.7.1 方法一
使用Molecular Devices酶标仪，在450 nm处测定VEGF165检测板各孔的A值。根据VEGF165的标准曲线计算VEGF Trap供试品和标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量。然后以VEGF Trap供试品及标准品浓度的对数值为横坐标，对应的VEGF165含量值为纵坐标，进行四参数方程曲线拟合。计算供试品和标准品的半数抑制浓度（IC50），按照公式：结合活性（%）=供试品的IC50/标准品的IC50×100%，计算出供试品的结合活性。
1.7.2 方法二
使用Molecular Devices酶标仪，在450 nm处测定VEGF165检测板各孔的OD值。以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标，OD450值为纵坐标，进行四参数方程曲线拟合。计算标准品和供试品的半数抑制浓度（IC50），按照公式：相对结合力（%）=供试品的IC50/标准品的IC50× 100%，计算出供试品的结合活性。
1.8 试验有效性
VEGF标准曲线线性回归分析R2值必须不低于0.98；40 pmoL·L-1VEGF165质控的3个重复孔中，应有2个在28~52 pmoL·L-1；6 pmoL·L-1 VEGF165质控的3个重复孔中，应有2个4~9 pmoL·L-1。标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析R2值必须不低于0.98；标准品的IC50值必须在2~5 pmoL·L-1。只有同时满足上述条件时，才视为试验有效。按下式计算VEGF Trap的相对结合力，65%~135%为合格。
2 结果
2.1 方法一
在450 nm下测定结合板每一个孔的吸光度值。根据VEGF165标准品的浓度值及吸光度值绘制VEGF165标准曲线，分别计算出质控点VEGF Trap供试品和标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量，结果如表 1及表 2所示。
表 1 VEGF Trap标准品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量
表 2 VEGF Trap供试品各浓度梯度下未结合的VEGF165的量
VEGF165标准曲线线性回归方程：Y=0.081+0.028x，R2值为0.999，曲线如图 1所示；VEGF165标准品各个浓度与吸光度值的对应关系如表 3所示；40 pmoL·L-1VEGF165质控的3个重复孔值分别为46.12、46.31、43.66 pmoL·L-1；6 pmoL·L-1 VEGF165质控的3个重复孔值分别为5.32、5.69、6.10 pmoL·L-1。以VEGF Trap供试品及标准品浓度的对数值为横坐标，对应的VEGF165含量值为纵坐标，进行四参数方程曲线拟合，分别绘制供试品和标准品的曲线，求出供试品和标准品的半数抑制浓度分别为3.68和3.6 pmoL·L-1，标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析方程：Y=9.961/（1+x/3.68）2.11+0.639，R2值为0.997，如图 2所示。以上均满足该试验的有效性条件，所以试验有效。计算供试品的结合活性为102%。
图 1 VEGF165标准曲线
表 3 VEGF165标准品浓度及吸光度值
图 2 未结合的VEGF165与VEGF Trap浓度对应关系曲线
2.2 方法二
在450 nm直接测定VEGF165检测板各孔的吸光度值。直接以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标，OD450值为纵坐标，进行四参数方程曲线拟合，曲线如图 3所示。标准品与供试品结合曲线的非线性回归分析的R2值分别为0.997。回归方程：y=0.2771/（1+x/3.68）2.11+0.0989。计算供试品和标准品的半数抑制浓度（IC50）分别为3.68和3.6 pmoL·L-1，VEGF165标准曲线和各个质控孔的值同上。均满足试验有效性条件，计算供试品的结合活性为102%。
图 3 未结合的VEGF165吸光度值与VEGF Trap浓度对应关系
3 讨论
经过两种方法的对比表明，以VEGF Trap标准品及供试品浓度的对数值为横坐标，以未结合的VEGF165的量值或直接以未结合的VEGF165的吸光度值为纵坐标，计算得到的VEGF Trap的结合活性一致。
结合活性的计算方法为待测供试品与标准品IC50（半数抑制浓度）之比，而半数抑制浓度为纵坐标是S形曲线上下渐近线差值中点时，横坐标所表示的值，即其所对应的VEGF Trap浓度；理论上，无论以未结合的VEGF165的量值或直接以未结合的VEGF165的吸光度值为纵坐标，两者所得到的横坐标即对应的VEGF Trap浓度一致，纵坐标VEGF165的量值或未结合的VEGF165的吸光度值本身存在着一定的y=kx+b的直线关系，计算半数抑制浓度时，利用了上下渐近线的差值，使得b值被消除，所以方法一和方法二得到的曲线实际上只是纵坐标被放大了k倍，而对应的横坐标相同，这是两种方法得到相同的结合活性的理论依据。
本研究中，方法二计算上操作简便，不用再将VEGF165的OD值转换成VEGF165的含量值；方法一，虽然要经过计算未结合的VEGF165这一步骤，但转换后四参数的图形的纵坐标变大，且直接以未结合的VEGF165的量来表示更加直观。目前，SoftMax公司有专门的软件GXP，能够通过OD值直接转换成VEGF165的含量值，并绘制VEGF165的含量值对VEGF Trap浓度的四参数曲线，十分方便，但需单独购买该软件，需要一定的成本。
本研究比较了用于VEGF Trap结合力试验的两种计算方法，结果表明，两种方法结果一致，在实践中具体采用哪种方法，可根据实际情况而定。
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