前言

 

现在审评老师对于申报资料中方法开发的内容越来越重视，不同前些年方法可以如同天上掉下来只要有方法验证的内容就可以。上有所好下必甚，在这样的情况下，越来越多的企业要求撰写方法开发报告，方法开发报告应该怎么写？这是一个值得探讨的问题。本人根据自己的工作经历阐述对于该问题的理解，个人浅见，作抛砖引玉之用。

 

需要说明的是下文涉及的举例主要以有关物质反相HPLC方法开发为主，其他如GC、正相方法开发报告可以参考其思路。

 

解剖质量标准

 

方法开发的成果最终要成为质量标准收载的检测方法，所以如果我们详细剖析质量标准检测方法包含的内容，就能明白方法开发的过程到底需要说明哪些内容。以2015年版《中国药典》中收载的山梨醇原料药有关物质检测方法为例：

 

取本品约0.5g,置1 0ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;精密量取2ml，置1 0 0m l量瓶中，用水稀释至刻度,摇匀，作为对照溶液。分别取甘露醇对照品与山梨醇对照品各约0.5g,置10ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度，摇匀,作为系统适用性溶液。照高效液相色谱法（通则0512)试验,用磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子钙型交换柱(或分离效能相当的色谱柱）；以水为流动相;流速为每分钟0.5ml,柱温72〜85℃ ,示差折光检测器。取系统适用性溶液20μl注人液相色谱仪,甘露醇峰与山梨醇峰的分离度应大于2.0。精密量取对照溶液与供试品溶液各20μl分别注人液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积( 2.0 % )，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(3.0% ) 。上文可看出，从“取本品适量”到“作为系统适用性溶液”，一段很长的文字都是说明样品如何处理；之后到“示差折光检测器”说的是色谱条件；之后到“分离度应大于2.0”说明系统适用性试验的要求；从“供试品溶液中如有杂质峰”到“1.5倍(3.0% )”说明了计算方法与限度要求。

 

检测方法的剖析告诉我们一个检测方法包含样品处理、色谱条件、系统适用性试验、计算方法与限度五个方面的内容，除限度外，其余四个方面都需要在方法开发过程中进行阐述，即说明相应抉择的合理性，这就意味着方法开发过程伴随着验证的过程，因为很多内容需要用数据证明其合理性。限度的确定应当根据相应规范和研究数据确定，不在本文中论述。下文为一个方法开发报告的模板，主要以有关物质为例，其他如含量测定、异构体方法可以此为参考。

 

 

有关物质方法学开发报告模板

 

封面、目录、页眉、页脚等内容读者请按照各自公司的要求撰写。

  

1概述

 

说明研究所处的状态、分析方法开发的必要性，示例如下：

 

xxxx项目于xxxx年xx月xx日开始原料药打通工艺的研究，分析需要配合进行中控工作，因此需要开发原料药中控方法。

  

2范围

 

说明开发的方法适用的范围。示例如下：

 

适用于xxxx项目的原料药中控检测。

 

3参考依据

 

列举方法开发过程中参考的文献，如药典标准、现行标准、研究文献等。示例如下：

 

《中国药典》2015年版二部xxxx原料药质量标准。

 

4材料和仪器

 

以表格的形式列举方法开发过程中用到的仪器、试剂、对照品、供试品等信息。

 

5方法开发过程

 

本节主要说明上文所述的样品处理、色谱条件、系统适用性试验、计算方法四个方面的选择过程。需要澄清的是色谱条件、样品处理并无时间上的先后顺序，计算方法与系统适用性试验评估一般是在色谱条件与样品处理确定之后。

 

5.1   初始条件

说明初始条件选择的依据，如参考某个文献、药典标准、现行标准，可以表格的形式或药典格式列出初始条件的各个参数。示例如下：

 

色谱柱
流动相
洗脱程序
流速
柱温
波长
进样体积
进样器温度
稀释剂
供试品浓度
对照溶液

 

在初始条件下进样分析，对检测结果进行评估，并拟定下一步的优化方向，提供数据与图谱说明该项研究的结论。

 

5.2   样品处理

在该项下应当研究包括供试品、杂质对照品等检测涉及的物料的处理方法，并证明处理方法的合理性。主要从三个方面说明样品处理方法的合理性：稀释剂选择、浓度与处理方式。

 

1) 稀释剂选择

一般从溶解性、溶液稳定性、专属性和溶剂效应四个方面说明稀释剂选择的合理性。在该项研究中需要提供溶解度的数据、典型色谱图和溶液稳定性验证的数据。

 

目标物在用该稀释剂配制的溶液中应有良好的稳定性，这需要用数据证明，所以在方法开发中需要做溶液稳定性验证。可能有读者会有疑问，溶液稳定性验证在方法验证中不是要做吗，为什么方法开发也需要呢？方法开发过程是一个抉择证成的过程，做出的选择与判断需要证明其合理性。方法开发过程的溶液稳定性验证是一个探索性的验证，可能会有几种不同的稀释剂的数据，最终找出一个适合的稀释剂。在溶液稳定性的研究中，可以同步研究供试品溶液的放置条件，如室温下不稳定，研究在控温条件（如5℃）下供试品溶液是否稳定。示例如下：“由上述结果可知，供试品在5℃放置24小时稳定。故选择乙腈-水（1：1）作为本品的稀释剂，并建议进样器温度设为5℃。”

 

除了溶解性与溶液稳定性符合要求外，还需要确认该稀释剂不会对检测有干扰；且相应组分的峰型符合要求，即该稀释剂不会产生溶剂效应。溶剂效应相关内容见相关阅读《论液相色谱的溶剂效应》。

 

2) 浓度

供试品溶液的浓度应当符合检测的要求，响应值应当在一定的范围内。有关物质供试品的浓度应满足灵敏度和分离度的两个互相约束要求，想要良好的灵敏度，浓度越高越好，过高则导致主峰严重展宽，影响与相邻峰的分离度。

 

计算方法也约束浓度的选择，如有关物质检测拟用面积归一化法计算杂质含量，则拟定的供试品浓度下主峰应在线性范围内，需要配制从定量限到供试品浓度的120%不同浓度的线性溶液进行线性验证，相关系数与截距均应符合要求。

 

以API有关物质为例，说明方法开发中如何说明浓度的选择。原料药的鉴定限度一般为0.10%，为了使方法有足够的灵敏度，定量限拟低于0.01%，将拟定浓度的供试品溶液稀释一万倍，进样分析，信噪比应大于10，同时供试品溶液的色谱图上各组分分离度应符合要求。实际工作中是配制一份稀释后的供试品溶液，评估其信噪比，再计算供试品浓度。例如0.1μg/ml的供试品溶液信噪比为20，如以该浓度为定量限，则乘以一万倍得出1mg/ml为供试品溶液浓度。

 

示例如下：

名称	浓度（μg/ml）	S/N
xxxx	0.2	38
杂质A	0.2	24

 

为提高本品有关物质的检测灵敏度，是限度浓度的杂质A峰信噪比大于100，需将杂质A的限度（0.1%）浓度提高至1μg/ml，其对应的供试品浓度为1mg/ml。

 

3) 处理方式

如果只是溶解操作可不研究该项，但一些特殊的样品处理方式需要证明处理方式的合理性，如萃取、沉淀、过滤、超声等操作。如过滤需要研究滤膜吸附与是否引入干扰组分、萃取沉淀操作可能需要研究加标后的样品处理后的回收率数据、超声需要研究超声时间与供试品稳定性等。示例如下：

 

取xxxx项下杂质混合溶液，经PVDF滤膜滤过，分别弃去0ml、1ml、2ml、3ml、5ml、10ml，去续滤液进样分析，计算各组分峰面积与未过滤杂质混合溶液各组分峰面积的比值；同时考察稀释剂经PVDF滤膜滤过分别弃去0ml、1ml、2ml、3ml、5ml、10ml后是否干扰本品检测。

 

5.3 色谱条件选择          

一般应当参考文献资料或者根据理论确定一个初始色谱条件，进行检测分析，并对结果进行评估，如初始条件不适用，则进行相应的调整。下文我们分别对流动相、洗脱程序、流速、色谱柱、柱温、检测波长等参数的选择过程进行讨论。

 

1) 流动相

水相是用纯水或者缓冲盐，缓冲盐的种类、pH值和浓度的选择均需做出合理的解释，并用试验结果证明选择的合理性。缓冲盐的相关内容见相关阅读《方法开发缓冲盐选择指南》。示例如下：

 

根据xxxx化学结构式推测其存在酮式烯醇式互变情况，且应以烯醇式为主，流动相pH值不应过低，否则可能产生酮式异构体峰。结合以上情况（前文已说明高pH值流动相不适用），拟定pH值在4~5之间。因拟定的检测波长为230nm，不宜使用醋酸盐与甲酸盐。供试品为路易斯酸，对流动相缓冲能力要求不高，可尝试0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH4.6左右）。

 

应说明选择流动相的有机相的理由或者依据，并用试验数据说明选择的合理性。示例如下：

 

当有机相为纯乙腈时，杂质A与xxxx峰基本重叠（图1-1）；当有机相为甲醇时，杂质A与xxxx峰保留时间均发生明显变化，但xxxx峰与未知相邻峰重叠（图1-2）；当有机相为甲醇-乙腈（1：1）时，xxxx峰与杂质A、未知相邻峰达成良好分离（图1-3）。故选定有机相为甲醇-乙腈（1：1）。

 

2) 洗脱程序

一般可以先通过等度研究确定是否需要梯度洗脱，如果等度研究表明各组2.2min分保留相差非常大，则需要梯度（多数情况是这样）；如保留较为接近，可用等度。从高比例有机相（如80%有机相）逐渐降低有机相比例进行等度洗脱，确定各组分的保留情况。如果等度研究表明供试品中60%有机相存在保留时间5分钟的组分，那么梯度上限设置成40%就很难将该组分洗脱下来。

 

以有关物质为例，供试品中的各个组分（主成分与杂质）在拟定的洗脱程序中均应有适当的保留，即保留最弱的组分保留时间应大于死时间（含量测定可以不用关注这个），保留最强的组分应能被洗脱下来。这也就意味着方法开发是一个反复确认的过程，比如一般在最开始的阶段，缺乏杂质对照品，后来新增已知杂质的保留情况不清楚，那么到后期需要确认在拟定的洗脱程序中新增的已知杂质有适当的保留。中试阶段或者生产阶段的供试品，因仪器设备、批量与早期方法开发时期的供试品不一样，可能导致杂质谱不一致（这也是审评老师要求用中试批次做方法验证的主要原因），需要重新确认大批量生产供试品中实际存在杂质在原来拟定的洗脱程序中的分离与保留情况。

 

示例如下：

由上述试验结果可知，在该色谱条件下在xxxx峰（13min左右）后未检出其他组分峰，说明供试品各组分在13min左右已完全洗脱，此时有机相比例约为56%，等度研究数据也显示有机相比例为60%时供试品溶液中没有保留时间明显大于死时间（2.2min）的组分峰，故将有机相梯度上限设为65%。

 

3) 色谱柱

应当先说明选择色谱柱的思路，然后用数据证明选择的正确性。一般是研究分离度、拖尾因子、理论板数等数据。选择色谱柱的注意事项见相关阅读《如何选择液相色谱柱》。示例如下：

 

配合流动性的筛选过程，筛选了8根不同型号的色谱柱，发现其中7根色谱柱中均有杂质峰与xxxx峰重叠（图2-1）；只有色谱柱Agilent Extend-C18(4.6×250mm，5μm)可以将xxxx峰与相邻杂质峰分离（图2-2）.色谱柱筛选结果见下表……

 

4) 柱温、流速

这两项可以根据经验或者参考文献设置，但需要进行少许变动证明初始设置的耐用性。示例如下：

 

柱温耐用性研究显示加标溶液的色谱图中杂质A峰与xxxx峰分离度随着柱温的升高得到改善（图3-1），在柱温为45℃时，杂质A峰与xxxx峰分离度为2.5，满足检测需要，更高的温度不利于色谱柱寿命，故将柱温设置为45℃。

 

5) 进样体积

以常规液相为例，如进样体积为常见的10μl、20μl，一般配合样品浓度说明供试品进样量符合要求即可。如更小的体积3μl或更大的体积100μl等，需要证明选择的合理性。小体积需要证明连续进样的精密度符合要求，大体积需要证明柱外死体积的增加对峰型、柱效等没有带来不可接受的不利影响。

 

6) 检测波长

该项下需提供各组分（包括主成分、已知杂质、主要未知杂质）的光谱图与最大最小吸收波长的数据，说明波长选择的思路与依据。示例如下：

 

根据主成分与杂质A的光谱图（图4-1），其最大吸收波长分别为310nm与230nm，为提高检测灵敏度，暂定检测波长为杂质A的最大吸收波长230nm，该波长为主成分光谱图的峰谷处，在此波长下主成分与杂质A的响应对波长的波动均有较好的耐用性。

 

5.4 系统适用性试验评估

根据上文的研究结果评估检测方法的高风险因素，并将其定入系统适用性试验考察内容，常见的高风险因素一般有分离度、灵敏度、柱效、拖尾因子、进样精密度等。需要列举相应的数据，必要时进行耐用性研究。示例如下：

 

由上述数据可知，各已知杂质、主成分之间的分离度在耐用性研究中均大于5.0，已知杂质分离度的风险较小；强制降解研究的结果显示主峰后有相邻降解杂质生成，耐用性研究的结果显示分离度最小值为1.8，该方法的降解杂质风险较高。故拟在系统适用性试验中考察主峰与降解杂质的分离情况。系统适用性的考察方法为：去xxxx对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，在沸水浴中放置20分钟，取出，防冷，作为系统适用性溶液。去20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。Xxxx与其相邻杂质峰之间的分离度应不小于1.5。

 

5.5  计算方法         

需要说明拟定计算方法的思路，并用试验数据说明计算方法的合理性。如原料药中控方法拟采用面积归一化法，则需证明供试品溶液的浓度在线性范围内；如拟采用加校正因子的自身对照法计算有关物质含量，则需证明各杂质的校正因子的值在适当的范围内。示例如下：

 

因为杂质A对照品较难获得，且稳定性非常差，拟采用加校正因子的主成分外标法计算供试品中杂质A的含量……根据两者线性结果计算的杂质A校正因子为1.4，在0.2~5之间，可以采用加校正因子的主成分外标法计算供试品中该杂质的含量。

 

5.6 总结

该节总结上述研究的成果。

 

1)       色谱条件

根据上述的开发成果，暂定本品有关物质检测的色谱条件如下：

色谱柱
流动相
洗脱程序
流速
柱温
波长
进样体积
进样器温度
稀释剂
供试品浓度
对照溶液

2) 溶液配制

说明供试品溶液、杂质对照品溶液、系统适用性溶液等的配制方法。

3) 系统适用性试验

略

4) 计算公式

根据计算方法的研究结果列出采用的计算公式。

5) 测定

略

6) 可接受标准

略

 

6方法预验证

 

根据上述研究的结果，评估检测方法可能存在的风险，必要时进行预验证。如在方法开发的早期，没有降解杂质对照品，可进行强制降解试验评估暂定的色谱条件下降解杂质的分离情况。

 

7结论

 

根据研究的结果说明开发的方法是否适用于检测的目的。

 

8修改历史

 

方法开发不是一次性的过程，比如方法开发早期没有杂质对照品，到后期获得对照品后需要重新确认原来的色谱条件是否仍然适用；比如中试样品的杂质谱可能不同于小试样品，小试阶段开发的检测方法是否适用于中试样品的检测都需要重新确认，所以方法开发报告在各阶段应当根据最新的研究情况进行更新。

文件编号	起草日期	主要表更描述

 

后叙

 

 

方法开发的过程，也是一个证成的过程，即每个选择均需要证明其合理性。方法开发与方法验证并没有明确的分界线，事实上方法开发报告里包含了大量的方法验证的数据，只是没有正式的方法验证中那么完整的内容。方法开发阶段的数据可以作为正式验证的参考，如方法开发阶段研究了降解杂质的分离情况，则其研究数据可以用来评估正式验证中的强制降解条件。

 

QBD的理念也可用于方法开发的过程，在方法开发阶段对方法的风险评估越全面和系统，在检测工作和正式验证中出现问题的可能性就越小，所以强烈推荐在方法开发时按照本文的模板进行系统的研究，以减少后期出现的麻烦。我想没人愿意在使用了一个方法检测样品数个月或者在获得中试产品进行正式验证中发现方法有一个重大问题不能用，这种情况的发生有时候对一个项目可能产生致命的影响。

 

最后再次表达一下本人的观点：方法开发不只是选择色谱条件，每一个选择都需要证明其合理性，在方法开发的过程中需要对方法进行系统的风险评估。