遗传毒性试验是采用哺乳动物或非哺乳动物细胞、细菌、酵母菌、真菌或整体动物测定试验样品是否会引起基因突变、染色体结构畸变以及其他DNA或基因变化的试验。遗传毒性试验的主要目的是研究医疗产品导致人体基因改变，并能通过生殖细胞传递至下一代的潜力。

遗传毒性试验用于检测两类主要的遗传损伤：基因突变（点突变）和染色体损伤（结构畸变、数目畸变）。单一试验无法检测出所有相关遗传毒性物质，通常进行一组试验，试验组合包括：细菌回复突变试验，体外哺乳动物染色体畸变试验，体外小鼠淋巴瘤TK试验，体外哺乳动物细胞微核试验。

如果按照以上进行遗传毒性试验且两个体外试验的结果均为阴性，则不需进行进一步的动物体内遗传毒性试验。如果任意体外遗传毒性试验的结果为阳性，则应进行体内诱变性试验，否则推定为诱变物。应在体外试验确定出的最适宜终点的基础上选择相应的体内试验，通常采用的体内试验有：啮齿动物体内微核试验，啮齿动物骨髓中期分析，转基因基因突变试验。

本篇主要具体介绍细菌回复突变试验和体外哺乳动物染色体畸变试验两种体外试验，以及体外小鼠淋巴瘤TK试验和体内哺乳动物红细胞微核试验。

细菌回复突变试验

OECD 471给出的细菌回复突变试验，经修改适用于医疗器械。在评估医疗器械的遗传毒性潜力时，可以使用医疗器械材料、浸提液或提取及蒸发的残留物

细菌选择：使用指数生长晚期或稳定生长期早期的细菌培养物（约109个细胞/mL），培养温度为37℃，推荐的菌株有鼠伤寒沙门氏菌TA1535，TA1537，TA97，TA97a，TA98和TA100，大肠杆菌WP2uvrA，WP2uvrA（pKM10l）。

样品的准备：可溶解或悬浮在溶剂中的医疗器械或材料可直接用于测试；不溶于溶剂的医疗器械或材料可用浸提液作为受试样品，受试浸提液应在制备后的24小时内使用。如可能，浸提液应在制备后立即使用，以防止吸附在提取容器上或发生其他组分变化。

试验步骤：对于平板掺入法，在没有代谢活化系统的情况下，将0.1ml的受试样品、0.1ml的新鲜细菌培养物（含有至少108个活细胞）和0.5ml无菌缓冲液与2.0ml顶层琼脂混合。

对于有代谢活化系统的试验，将0.5ml含有足量线粒体后组分（体积分数为代谢活化混合物的5%至10%）的代谢活化混合物与细菌和受试样品/受试溶液一起与顶层琼脂混合（2.0 ml）。将每个管中的内容物混合并倾倒在最低营养琼脂平板的表面，待顶层琼脂凝固后再进行孵育。37℃孵育48h-72h。结束孵育后对每个平板中的回复突变菌落数进行计数。

自动菌落计数仪应采用一系列真实的手工计数平板进行校准，这些平板须涵盖一定范围的突变菌落，包括从极低到极高的数量和不同大小的菌落。数据应当以每个平板的回复突变菌落数来表示。同时还应当给出阴性（溶剂对照和未处理对照，如果有使用）和阳性对照平板上的回复突变菌落数。

应当给出受试样品以及阳性和阴性（未处理和/或溶剂）对照的各个平板回复突变菌落计数、平均回复突变菌落数以及标准偏差。

细菌回复突变试验的阳性结果表明该受试物能够通过鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌基因组的碱基置换或移码突变而诱发点突变。阴性结果表明，在本试验条件下，受试样品不会诱发试验菌株的突变。 

体外哺乳动物染色体畸变试验

 OECD 473给出的体外哺乳动物染色体畸变试验，经修改适用于医疗器械。在有和没有代谢活化系统的情况下将细胞培养物暴露于受试样品中，然后按照预定的时间间隔，用中期分裂相阻断剂(如秋水仙碱)进行处理，然后收获、染色，并用显微镜分析中期分裂相细胞存在的染色体畸变。

细胞选择：仓鼠CHO、V79和CHL细胞系、其他哺乳动物的外周血淋巴细胞，培养温度为37℃。

样品准备：可溶解或悬浮在溶剂中的医疗器械或材料可直接用于测试，不溶于溶剂的医疗器械或材料可以使用浸提液作为受试样品。受试浸提液应在制备后的24小时内使用。如可能，浸提液应在制备后立即使用，以防止吸附在提取容器上或发生其他组分变化。

试验步骤：在首次实验中，应在有和没有代谢活化系统的情况下，用受试样品对增殖期的细胞进行染毒，淋巴细胞应在刺激有丝分裂后约48h开始染毒。细胞暴露于受试样品中3h-6h，并在染毒开始后约相当于1.5个正常细胞周期时采样。通常用秋水仙碱处理细胞培养物1h至3h，收获每个细胞培养物并单独处理以制备染色体，染色体制备包括细胞的低渗处理、固定和染色。

实验的单位是细胞，应评估具有染色体结构畸变的细胞百分比。应列出实验和对照培养物中不同类型的染色体结构畸变的数量和频率，记录主要畸变实验中同期测定的所有处理培养物和阴性对照培养物的细胞毒性，提供各个培养物的数据，所有数据都应以表格形式进行汇总。

体外染色体畸变试验的阳性结果表明，受试样品可诱发培养的哺乳动物体细胞发生染色体结构畸变。阴性结果表明，在本试验条件下，受试样品不会诱发培养的哺乳动物体细胞的染色体畸变。 

问与答

Q:进行遗传毒试验时，是否需要同时做体外和体内动物试验?

A:不需要，当两个体外遗传毒性试验的结果均为阴性，则不需进行动物体内遗传毒性试验；如果任意体外遗传毒性试验的结果为阳性，则应进行体内诱变性试验。

Q:体外试验的结果为阳性时，是否需要做全部的体内动物毒性试验？

A：不需要，当有体外毒性试验的结果为阳性时，应在体外试验确定出的最适宜终点的基础上选择相应的体内试验。

Q：实验室进行生物学评价遗传毒性试验时，一般应怎样进行试验？

A：实验室一般先做细菌回复试验和体外细胞染色体畸变试验，或者细菌回复试验和基因突变试验，如果两组试验中出现任意试验阳性结果，再进行体内试验：哺乳动物红细胞微核试验。

体外小鼠淋巴瘤TK试验

OECD 475给出的小鼠淋巴瘤TK试验，即体外哺乳动物细胞基因突变试验，包括检测大克隆和小克隆，经修改后适用于医疗器械。胸苷激酶（TK）丰富的细胞对嘧啶类似物三氟胸苷(TFT)敏感，会导致细胞代谢受到抑制并停止进一步的细胞分裂。突变细胞能够在TFT存在的情况下增殖，而含有胸苷激酶的正常细胞则不能。

细胞选择：试验中使用的是小鼠淋巴瘤细胞L5178Y TK+/-的亚克隆细胞，应得到目标细胞系且有足够的细胞性能，检查细胞是否有支原体污染，如果细胞被污染，则不应使用。培养基的渗透压和pH值应在生理范围内。

可溶解或悬浮在溶剂中的医疗器械或材料可直接用于测试。不溶于溶剂的医疗器械或材料可以使用浸提液作为受试样品，提取方法的选择取决于从受试样品中获得的可提取物的百分比。

试验步骤：确定每种受试培养物和对照培养物的细胞毒性，在采用软琼脂法进行小鼠淋巴瘤试验（MLA）时，使用相对总生长率（RTG）来进行测定。采用微孔检测方法时，使用相对存活率（RS）作为细胞毒性指标时。无论使用何种试验方法，均应使用相同的细胞毒性测量指标

在染毒期结束时，对细胞进行洗涤和培养，以测定存活率。通常在处理期之后开始通过测定培养物的相对存活率（RS）或相对总生长率（RTG）来检测细胞毒性。在软琼脂法中，突变频率（MF）是通过计数TFT抗性集落的数量并对选择性培养基中的接种细胞数用平板接种效率（PE）进行校正后确定的，即MF＝（突变体数/接种的细胞数）×PE。对于微孔法，使用泊松分布计算平板接种效率（PE）和突变频率（MF），然后计算突变频率：MF = [PE（突变）/ PE（生存）] x 106。

体外哺乳动物细胞基因突变试验的阳性结果表明，该受试样品可诱发所用的培养哺乳动物细胞的基因突变，具有可重复的正向浓度-反应关系是最有意义的。阴性结果表明，在本试验条件下，受试样品不会诱发所用的培养哺乳动物细胞的基因突变。 

体内哺乳动物红细胞微核试验

体内哺乳动物红细胞微核试验适用于采用OECD474进行检测的医疗器械，通过适当的途径使动物暴露于受试样品中；如果使用骨髓，则在染毒后的适当时间处死动物，提取骨髓，并制备涂片（玻片）并染色。当使用外周血时，则在染毒后的适当时间收集血液，并进行涂片制备和染色。对于采用外周血进行的研究，最后一次染毒与细胞收获之间的间隔时间应尽可能短，分析制片中存在的微核。

动物选择：如果使用骨髓，建议使用小鼠或大鼠，也可以用其他合适的哺乳动物。当使用外周血时，建议使用小鼠；健康的初成年动物被随机分为对照组和处理组。

试验步骤：根据合适的染毒方案进行染毒，生理盐水可以静脉内注射，小鼠最高20 ml/kg，大鼠最高10 ml/kg；有机溶媒或提取物可采用腹腔注射，小鼠的剂量可以是20 ml/kg，大鼠可以是10 ml/kg。

对于骨髓和外周血，采用镜检方法，每只动物至少计数2000个嗜多染红细胞（RET）或网状红细胞（RET），以计算有微核的嗜多染红细胞（MN-PCE）/网织红细胞（MN-RET）的发生率。

对于外周血，使用细胞计数法，对每只动物计数约20000个网织红细胞（不成熟红细胞）。通过对存在微核的正染红细胞（NCE）（MN-NCE）进行计数，可以获得其他信息。

每只动物的骨髓数据应以表格形式列出，实验单元是动物，对于每只雄性和雌性动物，应记录以下数据：嗜多染红细胞的数量、正染红细胞的数量以及有微核的嗜多染红细胞和有微核的正染红细胞的数量。应对每只动物计算嗜多染红细胞占总红细胞的比例（PCE/EC比值）。汇总表应显示每个处理组在每个采样时间的有微核的嗜多染红细胞的组发生率、有微核的嗜多染红细胞的平均发生率以及嗜多染红细胞占总红细胞的比例。

受试样品中有微核的嗜多染红细胞的发生频率增加，则出于质量控制目的，可以对有微核的正染红细胞进行计数，因为任何给定玻片中的伪象会使正染红细胞和嗜多染红细胞的“微核”发生率都明显增加，也可以将有微核的正染红细胞的平均发生率制成表格。

阴性结果表明，在本试验条件下，受试样品不会引起受试动物的不成熟红细胞产生微核。

如果不符合阳性或阴性遗传毒性反应的标准，则结果可被判定为模棱两可或不确定，应进行进一步的试验，并且最好采用调整过的实验条件。可以从每只处理动物和对照动物中获得额外的PCE（+2000）计数结果，以确证结果。 

问与答

Q：进行遗传毒试验时，是否需要同时做体外和体内动物试验?

A:不需要，当两个体外遗传毒性试验的结果均为阴性，则不需进行动物体内遗传毒性试验；如果任意体外遗传毒性试验的结果为阳性，则应进行体内诱变性试验。

Q:体外试验的结果为阳性时，是否需要做全部的体内动物毒性试验？

A：不需要，当有体外毒性试验的结果为阳性时，应在体外试验确定出的最适宜终点的基础上选择相应的体内试验。

Q：实验室进行生物学评价遗传毒性试验时，一般应怎样进行试验？

A：实验室一般先做细菌回复试验和体外细胞染色体畸变试验，或者细菌回复试验和基因突变试验，如果两组试验中出现任意试验阳性结果，再进行体内试验：哺乳动物红细胞微核试验。