样品检验和方法学验证时样品测定个数和进样针数的选择，是药品检验领域中分析人员平时经常遇到，并永远都在纠结的问题。目前，已有优秀的作者结合《中国药典》2015年版等法规进行了总结（药物常规检查项与方法学验证测定/进样针数讨论，见参考文献1）。高效液相操作简单，分析速度快，通用性强，是目前药企配置的最基本检验仪器之一，对高效液相检验时重复样与进针次数讨论具有重要的价值。高效液相检验的一般目的在于鉴别、有关物质检查、含量测定这3个主要目的，本文结合实际应用对目前使用最多的高效液相进样方式进行了简单的梳理。

鉴别试验，通常药典在进行含量测定的同时进行鉴别（参考文献2），而某些鉴别或者说比对，离子交换色谱（如抗体的酸碱峰）、肽图、异构体、中药指纹图谱这些则是半定量或者定性的实验。对于与含量测定一起进行的鉴别，应按照含量测定的要求，我们在下面介绍。对于半定量或者定性的实验，其通常的要求是供试品与对照品一致，简单点讲就是标准品1份1针、样品1份1针。系统适用性在除药典有要求的情况下进得比较少，通常可用对照品溶液的系统适用性结果来替代。

但在日常工作中，高效液相第一针出现异常的情况比较多见。因此即使是需要长时间梯度的肽图、指纹图谱等检验，每次工作时刚开始检验时，至少应加1个平衡色谱柱样品或者流动相空白样品，以防止色谱柱未清洗干净或因为流动相梯度初次变化带来的色谱图异常。在药检中对异常色谱图的解释绝对是件头疼的事。

有关物质检查即通常说的杂质鉴定和定量，主要包括加校正因子和不加校正因子的主成分自身对照法以及面积归一化法、杂质对照品法（外标法）。主成分自身对照法以及面积归一化法通常可在对主成分定量是同时进行，而杂质对照品法（外标法）则需要每次以杂质对照品溶液进行外标。总体上来说，有关物质检查和含量测定对重复样与进针次数通常与含量测定时一致的，可能的区别在于杂质鉴定需要增加峰鉴别溶液（1份，1针）。外标法是最常用的高效液相定量方法，下面以外标法的不同进行分别讨论。

2.1 单点外标法

在含量测定中，药物的含量通常是在均匀且固定的（标示量），含量检验的规定区间通常也是围绕标示量上下波动（如80%~120%）。因此，只要供试品浓度在线性范围内并尽可能地靠近对照品浓度，采用单点外标法可以获得更准确的判定结果，而进行线性拟合过程中有能引入更大的测定不确定度（参考文献3）。

2.1.1 常规进样方法

对于单点外标法而言，通常的进样方式如下表1，特别是对于化药来说：

表1 单点外标法的常规进样方式

此外，大家对于以上“对照品2份，5针+2针”的进样方式存在一些替代方式，包括“对照品1份，6针”；“对照品2份，3针+2针”等。在有方法学验证的基础上是可以理解的，但系统适用性试验作为分析方法不可或缺的一部分，可能受到监管机构越来越多的的挑战（参考文献4）。

2.1.2法规规定的生物药进样方法

在生物制品检验中，因为大分子药物的高效液相表现不如小分子化药，《中国药典》2015年版等法规规定的进样方法通常与以上常规的进样方法有所区别，法规规定的生物药进样方法见表2。

通常是采用对照品溶液1份进3针，供试品溶液1份进3针，以供试品峰面积平均值除以对照品溶液峰面积平均值（如参考文献5）。实际操作中，其系统适用性部分重复性指标大多以对照品和供试品的峰面积重复性代替，如对照品溶液3针、供试品溶液3针的峰面积RSD应不大于2%。

表2法规规定的生物药进样方法

2.2 线性回归法

对于同时测定浓度范围比较大的药品（特别是工艺步骤中浓度范围更大），需要进至少5个非零的梯度对照品来进行线性回归，再线性拟合得出供试品含量。其常规进样方法与单点进样法进样方法也基本一致。

对于线性回归法，比较适合的常规进样方式如下表3，特别是对于分析时间短的药物来说：

表3 线性回归法的常规进样方式

2.3 法规规定的特殊进样方法

在《中国药典》2015年版等法规，还有1种特殊的进样方法如3点线性回归法。这种方法应该是融合可单点对照法和线性回归法的优点。其特点在于在系统适用性通过后，对照品制备3个浓度，分别对应供试品标示量的不同范围（如50%、100%、150%，范围略大于或等于接受标准），回归后求出供试品含量。根据方法和检测器的不同，回归方式也有区别：如《通则3120 人血液制品中糖及糖醇测定法》用的示差检测器（RI）采用的是3点线性回归法[6]；而蒸发光散射检测器（ELSD）等质量型检测器采取的是3点对数线性回归，浙江所应用蒸发光散射检测器进行抗生素药品质量分析也主要采用的是以上进样方式。

简单分析，感觉法规规定的特殊进样方法就是对于这些不太稳定的方法或检测器，采取的一种基于单点外标对照思维的折中方法，其进样方式可参见表3。但由于比如RI、ELSD持续工作长时间下的不稳定情况，在检验任务大时，系统适用性通常不包括重复性指标，仅1份进1针；对照品溶液可以1份进1针；供试品溶液1份进1针。

三、小结与结论

1) 本文对现行法规和操作习惯下的高效液相检验时重复样与进针次数进行了简单的分析，对于不同检验药品，有着不同的进样方法。但以目前的趋势来看，符合USP、ICH规定的系统适用性要求会在国内法规上越来越严，如何针对产品特点做出符合法规精神的高效液相方法是必须考虑的问题。

2) 对于高效液相，除了其特殊的系统适用性以外，其重复样与进针次数核心精神还是参考法规对于鉴别、含量、杂质检定时的基本要求，在方法学设计和验证的时候要多考虑。尽可能以法规规定的方法做一个模板，这样在面对检查时解释起来也比较好解释。

3) 对于完全按标准进行的高效液相方法，其又可能存在着样品过多，分析时间过长，高效液相排期紧张，系统稳定性逐渐变差，也只能大家群策群力，多多考虑了。

参考文献：

1、梅希，药物常规检查项与方法学验证测定/进样针数讨论，药事纵横，2017-08-29.

2、孙会敏, 田颂九. 高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用[J]. 齐鲁药事, 2011, 31(1): 38-42.

3、陈华, 王慧. 关于线性回归法与单点外标法测量不确定度评估的初步探讨[J]. 药物分析杂志, 2008, 28(2):95-99.

4、李飞, 李云, 许真玉. 色谱系统适用性试验在分析方法使用中的重要性[J]. 中国新药杂志, 2019, 28(6):30-33.

5、2015年版《中国药典》三部通则3124 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法.

6、2015年版《中国药典》三部通则3120 人血液制品中糖及糖醇测定法.