作者：李洁 , 李同辉 , 梁改玲      

河南省食品药品检验所, 郑州 450018 

摘要：

目的: 对盐酸氮芥酊产生的降解产物进行结构解析，分析两种测定方法产生结果差异的原因和降解产物来源。方法: 采用碘量法和气相色谱法测定降解产物的含量，采用GC-MS法对降解产物结构进行解析。结果: 碘量法测定结果较气相色谱法偏高，降解产物为2-氯乙基-（2-乙氧基）-甲基胺，是由于盐酸氮芥与辅料发生反应而产生。结论: 降解产物消耗滴定液使碘量法测定结果偏高，气相色谱法专属性强，建议生产企业进一步研究该品种生产工艺和贮藏条件，避免或降低样品与辅料发生反应。

关键词：盐酸氮芥酊    碘量法    气相色谱法    气质联用法    降解产物    

盐酸氮芥酊为盐酸氮芥的无水乙醇溶液, 临床上主要用于治疗白癜风[1]。按照国家药典委员会2015年国家药品标准提高行动计划要求, 需对该品种现行质量标准[2]进行修订。现行标准含量测定方法为碘量法, 笔者将其修订为气相色谱法[3]时, 检出降解产物, 降解产物含量越高, 两种方法测定结果差异也越大, 本研究对该降解产物采用GC-MS进行结构解析, 推测降解产物结构, 分析两种测定方法产生结果差异的原因和降解产物来源, 优化产品质量控制手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Mettler T5电位滴定仪(瑞士Mettler Toledo公司, Mettler Toledo DMI 140-SC铂电极); Agilent 7890B气相色谱仪(G4513A自动进样器, 美国Agilent公司); Agilent 7010B GC/MS Triple Quad气质联用仪(美国Agilent公司); Mettler Toledo XPE 205电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 试药

盐酸氮芥酊(批号:171005005、161205006、160405001、150905002、150905003和150805001, 规格:50 mL:25 mg, 均由河南某企业提供); 盐酸氮芥原料(批号:180128001, 含量99.9%, 由制剂生产企业提供); 0.05 mol·L-1碘滴定液和0.1 mol·L-1硫代硫酸钠滴定液(均由本所配制标定), 无水乙醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 碘量法

精密量取本品50 mL, 置碘量瓶中, 加碳酸氢钠0.1 g, 精密加入硫代硫酸钠滴定液(0.1 mol·L-1)20 mL与水30 mL, 摇匀, 静置2.5 h(温度控制在25 ℃±2 ℃), 照电位滴定法用碘滴定液(0.05 mol·L-1)滴定, 并将滴定结果用空白试验校正。

2.2 气相色谱法

2.2.1 色谱条件[4]

色谱柱:DB-225色谱柱(Agilent, 0.53 mm× 30 m×1μm), 程序柱温:起始温度135 ℃, 维持1 min, 以8 ℃·min-1的速率升温至160 ℃, 维持6 min; 进样口温度:200 ℃, 检测器温度:250 ℃, 氮气流速:3 mL·min-1, 分流进样, 分流比: 5:1, 进样量:1 μL。

2.2.2 测定方法

取本品作为供试品溶液, 精密量取1 µL, 注入气相色谱仪, 见图 1; 另精密称取以五氧化二磷为干燥剂, 60 ℃减压干燥至恒重的盐酸氮芥原料适量, 用无水乙醇稀释制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液, 同法测定, 按外标法以峰面积计算。

1. 降解产物；2. 氮芥。

图 1 盐酸氮芥酊的GC图（DB-225色谱柱）  

2.3 测定结果

对2015年、2016年、2017年生产的6批样品在2018年7月(A)和2018年3月(B)分别采用碘量法和气相色谱法进行考察, 结果碘量法均较气相色谱法偏高, 见图 2。

图 2 2018年7月（A）和2018年3月（B）两种方法测定结果比较

每批样品的GC色谱图均显示检出降解产物, 按归一化法计算降解产物含量, 样品降解产物含量高的批次, 两种方法测定结果差异较大, 样品降解产物含量低的批次, 两种方法测定结果差异较小, 见图 3。

图 3 6批样品降解产物含量和两种方法测定结果差值比较

2.4 GC-MS方法

2.4.1 GC色谱条件[5]

色谱柱: D B - 5 M S (A g i l e n t, 3 0 m × 0. 2 5 mm×0.25µm); 程序升温:50℃维持1 min, 以15℃·min-1升温至150℃维持5 min, 再以30℃·min-1升温至230℃维持1 min; 载气:氦气(纯度≥99.999%); 进样口温度:230 ℃, 流速:1.0 mL·min-1;进样量:1 µL, 进样方式:分流进样, 分流比:10:1。

2.4.2 质谱条件[6]

电子轰击离子源(EI), 轰击电压:70 eV; 离子源温度:230 ℃, 传输线温度:280 ℃; 扫描模式:全扫描, 扫描质量范围:20~220。

2.4.3 测定结果

取样品直接进样, 在保留时间为6.508 min处检出降解产物峰, 见图 4。

1. 降解产物；2. 氮芥。

图 4 盐酸氮芥酊总离子流图（DB-5MS色谱柱）  

采用GC法(图 1), DB-225色谱柱检出降解产物峰在主峰前, 采用GC-MS法(图 4), DB5MS色谱柱检出降解产物峰在主峰后, 为了确保2根色谱柱检出的杂质峰为同一杂质峰, 使用DB5MS色谱柱在GC色谱仪上测定, 结果检出的降解产物峰也在主峰后, 计算批号为160405001样品在2根色谱柱上检出降解产物峰面积与主成分氮芥峰面积比值, DB-225色谱柱为0.55, DB-5MS色谱柱为0.48, 可以确定在GC-MS上主峰后的降解产物与GC上主峰前的降解产物为同一物质。

2.5 降解产物结构解析

将该降解产物进行谱库检索, 结果仍为氮芥, 但样品总离子流图中氮芥与降解产物为2个分离的色谱峰, 经与谱库检索MS图比较, 发现降解产物MS图中m/z为45、72、116和165在其谱库检索MS图中未发现, 见图 5。

图 5 样品中降解产物MS图（A）与谱库检索降解产物MS图（B）比对

根据这些m/z碎片推测该降解产物为2-氯乙基- (2-乙氧基)-甲基胺, 结构式为见图 6。即氮芥(见图 7)中1个Cl被CH3CH2O取代。其裂解规律见图 8。

  图 6 降解产物结构式

图 7 氮芥结构式

图 8 降解产物裂解规律  

由于该降解产物既不是合成盐酸氮芥的起始原料, 也不是反应中间体, 笔者也未购买到其对照品, 无法进行结构确证。

盐酸氮芥酊生产工艺为盐酸氮芥原料溶解在无水乙醇中, 推测降解途径为随着贮存时间延长, 氮芥中的1个Cl离子与乙醇发生反应产生该降解产物。见图 9。

图 9 推测降解途径

3 讨论

3.1 现行标准缺陷

现行标准含量测定采用碘量法, 碘滴定液既作为滴定剂也作为自身指示剂使用, 该方法所用指示剂到达滴定终点时颜色变化明显(无色→淡黄色), 但由于碘滴定液为红棕色溶液, 滴定管刻度线也为深色, 读取滴定终点消耗体积时不易看清刻度线引起较大误差。本文采用自动电位滴定仪测定, 由仪器报告滴定终点体积, 可避免人为读数不准造成的误差, 精密度高。文献[7]报道该方法测定结果受实验室温度影响较大, 且专属性差, 气相色谱法专属性强, 建议修订现行标准的含量测定方法。

3.2 碘量法较气相色谱法测定结果偏高原因分析

碘量法测定原理为盐酸氮芥中的两个氯离子与硫代硫酸钠滴定液反应生成氮芥的本提盐[8], 见图 10, 过量的硫代硫酸钠滴定液被碘滴定液滴定。由于氮芥降解产物仍含有1个Cl离子, 亦能消耗硫代硫酸钠滴定液, 故碘量法测定结果为盐酸氮芥和降解产物含量的总和, 而气相色谱法测定结果仅为盐酸氮芥的含量, 所以碘量法测定结果高于气相色谱法, 样品中降解产物量越大, 两种方法结果差异越大。

图 10 氮芥本提盐

3.3 盐酸氮芥酊稳定性

白癜风是临床上常见的获得性色素脱失性皮肤病, 目前临床上的治疗方法很多。盐酸氮芥酊为治疗白癫风的常用药物, 该药物经渗入皮肤后形成乙烯基亚胺基, 与巯基起作用, 激活、加速黑素细胞产生黑色素[9]。经对样品影响因素试验、加速试验和长期稳定性试验考察, 盐酸氮芥酊不稳定, 室温放置4天即与辅料发生反应产生降解产物, 该降解产物随贮存时间增加而增大, 在高温条件下降解更快, 在冷藏条件下降解较慢, 建议生产企业进一步研究该品种生产工艺和贮藏条件, 避免或降低样品与辅料发生反应。

3.4 降解产物性质

由于气相色谱法FID检测器为破坏型检测器, 无法制备降解产物纯品, 笔者试图采用LC-MS进行分析, LC进行制备, 均未检测到该杂质, 因此, 其结构和毒性目前尚无法确证。

参考文献

[1] 赵建林. 氮芥制剂治疗白癜风135例临床观察[J]. 临床皮肤科杂志, 1996, 25(5): 284-285.  

[2] 国家药典委员会.国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准: 第十五册[S]. 161-161.  

[3] 李洁. 气相色谱法测定盐酸氮芥酊含量[J]. 中国药房, 2013, 24(13): 1222-1224. DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2013.13.25  

[4] 张薇, 马长沙, 黄晓光, 等. 气相色谱法测定达比加群酯中10种溶剂的残留[J]. 中国药事, 2017, 31(3): 263-268.  

[5] 刘蔓, 方科益, 韩莹莹, 等. GC-MS法测定医用疫苗中抗氧化剂BHT的含量[J]. 中国药事, 2017, 31(11): 1331-1335.  

[6] 许勇, 苗水, 郏征伟, 等. GC-MS法检测化妆品中禁用物质氮芥的含量[J]. 中国卫生检验检疫杂志, 2012, 22(11): 2566-2570.  

[7] 李有富, 李魏林, 刘小敏. 实验温度对盐酸氮芥含量测定的影响[J]. 中国医药导报, 2011, 8(23): 61-62. DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2011.23.028  

[8] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 药典注释:中华人民共和国药典1990年版二部[J]. 北京:化学工业出版社, 1993, 591-592.  

[9] 王侠生, 杨国亮. 杨国亮皮肤病学[M]. 上海: 上海科技文献出版社, 2005: 654-655.