高效液相色谱 ( HPLC)广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。在使用过程中难免会遇到各种各样的问题，从而影响正常工作，如何快速发现故障、排除故障，并做好预防维护措施及其重要，本文列举了常见故障的排除及解决方法，仅供大家参考。

高效液相色谱 ( HPLC)故障排除原则

在仪器序列运行过程中发生故障时按发现故障、停止仪器序列运行、故障信息登记、确认故障来源、解除故障、故障维修登记、做好预防维护措施等步骤进行故障排查及解除故障，在故障排除过程中可遵循以下原则：

原则一：从最简单因素入手；

原则二：一次只变化一个因素，利于确认因素与问题之间的关系；

原则三：记录仪器正常状态的参数及异常状态信息，完整的记录是故障排除的关键步骤；

原则四：做好预防措施，加强仪器操作培训，正确的、良好的操作习惯是降低仪器故障率的首要条件。

高效液相色谱 ( HPLC)常见故障排除

1、压力高

压力偏高或超过压力上限一般是由方法问题、误操作、系统堵塞、压力传感器故障等问题引起。

方法问题：在方法建立时柱温、流速等参数建立不当，当使用小粒径色谱柱或背压大的色谱柱时，可降低流速或升高柱温（如35～40℃），以降低系统压力，该问题多发生在建立方法时。

误操作：当压力高于平时压力时首先检查柱温是否设置错误、流动相溶剂是否使用错误（如错将甲醇用成了粘度高的乙腈）、色谱柱是否拿错等误操作。

系统堵塞：排除方法问题及误操作后，排查是否系统堵塞，进行分段排查，可依次松开管路接头，从HPLC出口端开始，向上游泵逐个检查，这是发现堵塞部位最简单的方法，确定堵塞部位后可进行直接更换（如安捷伦的过滤白头等）、或超声清洗（如waters的在线过滤器等）、或反冲（如六通阀、进样针、针座、管路等部位），如超声清洗或反冲无效则需更换，经排查是保护柱或色谱柱堵塞时按相关方法冲洗。

压力传感器故障：上述排查后未发现压力高原因，则需要更换压力传感器，联系仪器客服咨询。

2、压力低

压力偏低或无压力一般是由误操作、漏夜、泵不输液等问题引起。

误操作：泵关闭、打开了排空阀等误操作引起无压力、柱温设置错误、用错溶剂、用错色谱柱等误操作可能导致压力偏低或偏高。

漏夜：压力偏低或无压力很多时候是由漏夜引起，配有漏夜感应器先确认哪个模块漏夜报错（此时已经严重漏夜），清除错误后重新启动泵排查该模块漏夜位置（用滤纸或纸巾逐个接口试漏），未配有漏夜感应器或轻微漏夜时由泵至检测器逐个接口排查（漏夜多发生在色谱柱接口及泵各接口）。确定漏夜位置根据漏夜原因进行处理，如接口松动重新拧紧、如密封圈磨损更换密封圈等。

泵不输液：流动相走空、管路中有空气、未充分排空、溶剂入口过滤头堵塞、单向阀污染均可能引起泵不输液。首先检查溶剂瓶内是否有溶剂、管路中是否充满气体，进行排空（如排空废液口无液体流出使用注射器手动抽，至有连续液体流出）；排空后依然无压力、压力偏低或压力波动，且废液口无废液流出，超声清洗单向阀或更换单向阀，无改善将溶剂入口过滤头取下，查看压力是否正常，如滤头堵塞超声清洗或更换（注：安捷伦溶剂入口过滤头为陶瓷材质，不可以超声，使用1%～10%硝酸浸泡过夜）。

3、压力波动

排气不充分或未排气、脱气机未开或故障、流动相中溶剂不互溶或易挥发、溶剂入口过滤头部分堵塞、单向阀污染、漏夜等均可导致压力波动。

排空不充分或未排空：发现压力波动首先进行流动相排空，一般排空后压力正常。

脱气机未开或故障：外置脱气机检查电源是否打开或报错（如安捷伦1100、1200，岛津20AT、20AD为外置脱气机）；内置脱气机检查泵是否有报错信息（如安捷伦1260等为内置脱气机）；waters e2695为内置脱气机在控制面板可以控制脱气机开关，需检查开关是否打开，压力是否小于1psi。

流动相中溶剂不互溶或易挥发：检查缓冲盐称量是否正确、是否混合均匀，检查溶剂是否互溶。

溶剂入口过滤头部分堵塞：查看溶剂入口过滤头周围是否有大量气泡，如果有大量气泡可能过滤头较脏，超声清洗，安捷伦陶瓷滤头用久了会变黑，取下1%～10%硝酸浸泡过夜。

单向阀污染：如排空后压力波动依然较大，取下单向阀超声清洗，多数情况可以解决。

漏夜：多数为柱塞杆密封圈磨损导致漏液，配有在线清洗时检查在线清洗液是否有明显增加（清洗液循环使用的），查看在线清洗管路出口端，在未清洗时是否有液体缓慢流出，如有液体流出说明，柱塞杆密封圈磨损导致漏液，更换密封圈或柱塞杆及密封圈。

4、保留时间变动

如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其原因很可能是流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速、在线混合时比例阀故障等。

流动相的组成：如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。

当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留通常会发生变化。检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。

如果您怀疑设备出现故障，请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统，然后再次运行。如果问题依然存在，则问题在于流动相或色谱柱；如果问题不再出现，则可能与仪器硬件故障或参数相关。

色谱柱化学（化学性质）变化：一般会在色谱柱使用数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。更换新柱以确定是否是柱老化导致的保留时间变动。

色谱柱温度变化：柱温变化会导致保留时间的变化，每1℃的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即“室温”条件），实验室温度通常会变化。尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。

流速变化：可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致流速与设定值发生变化，导致保留时间变化。

气泡问题：可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长。对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动。

泄漏也会延长保留时间。查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露。请特别注意色谱柱之前的接头。如果使用不锈钢配件，通常将接头螺母手动拧紧，再扳手拧紧1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接头时，应停止泵，松开接头，将管路推到接口端口的底部，再拧紧接头。拧紧PEEK接头时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。

单向阀污染或泵密圈磨损会导致流量偏低或波动，从而导致保留时间变化。单向阀污染可以进行超声清洗，随着使用时间的增加，泵密封圈会出现磨损，而且使用高浓度缓冲盐为流动相，会缩短泵密圈的使用寿命，可以根据使用情况及密封圈故障率定期更换密封圈，通常一年更换一次即可。

比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果，从而导致保留时间变化，下面介绍了一种检查流动相配比精度的简单方法：

将色谱柱柱更换为0.005英寸直径约1米长（0.12mm）的管道，流动相A为水，流动相B为0.1％丙酮的水，检测器波长设置为265nm，并使用足够高的流速使单向阀能够有效工作（例如2mL/min）。以10％为增量进行梯度变化（如流动相B由10％、20％、30％……90％至100％）。其结果应是平滑的阶梯状。

5、峰形问题

峰形常见问题有拖尾峰、伸舌峰、分叉峰、鬼峰等。

拖尾峰：

（1）碱性化合物与硅胶颗粒表面上的酸性或离子化硅烷醇基团之间相互作用而导致拖尾，选择经封端处理的色谱柱、添加扫尾剂如三乙胺，可以改善拖尾。

（2）缓冲液或离子对试剂浓度低也会导致峰拖尾，缓冲液主要用来使样品保持恒定的离子化状态，从而稳定保留时间，并在最大程度上减少因离子相互作用而导致的峰拖尾现象。缓冲液和离子对试剂的一个共同特征是作用效果（例如峰拖尾的减少、保留时间的稳定）会从低浓度开始显现，并随着浓度的增加而继续作用增加，但会逐渐维持在一个稳定水平。稳定水平之下的缓冲盐或离子对浓度，可以保持稳定的运行；浓度过高可能导致溶解性问题，新药特别注意。

（3）柱筛板堵塞引起峰拖尾或变形：柱筛板堵塞会影响样品在色谱柱入口端的分流，使得部分样品通过不同的流动路径到达色谱柱，因此会晚于另一部分样品。

由于此时未发生分离，因此所有分析物会以相同的方式变形（被扰乱），进而色谱图显示所有峰均具有相似（类似）的峰拖尾或变形。

注：色谱图中所有峰拖尾或峰变形通常是由物理作用导致的，而非化学作用，如下图： 

（4）死体积过大：当相同方法转移至其它仪器时出现色谱图中所有峰拖尾或变形可以排查是否死体积增大导致，管路长度、内径、接口处是否拧紧均可改变死体积。

伸舌峰（前拖峰）：

伸舌峰一般是由柱过载、柱结构塌陷、接口处死体积涡流、样品溶剂与流动相不兼容、柱温低等因素导致的。柱过窄、样品溶剂与流动相不兼容、柱温低等因素产生的伸舌峰一般发生在方法开发期间，需要筛选适合的柱温、稀释剂及进样浓度；稳定的方法忽然出现伸舌峰需要排查色谱柱是否塌陷及管路接口处是否对接紧密，特别注意色谱柱接口处，接口处的死体积容易产生涡流，导致伸舌峰。

分叉峰：

（1）色谱柱或保护柱入口端污染：如安装保护柱可不接保护柱或更换新的保护柱来排除，再更换新的色谱柱进行排除，确认是色谱柱污染，进行冲洗，冲洗无效，对色谱柱进行再生或更换色谱柱。

（2）筛板堵塞：关注色谱柱压力，如高于之前的压力，可能筛板堵塞，反冲色谱柱或更换色谱柱排查。

（3）样品稀释剂与流动相不兼容：在方法开发其间出现分叉峰时需要排查稀释剂与流动相的兼容性，建议选择流动相作为稀释剂，在日常检测中需要排查是否用错稀释剂。

（4）干扰峰：可能是样品中纯在的物质与目标物为分离，需要调节方法（调节流动相或更换色谱柱）改变选择性，可能是系统中引入的污染物，通过空白溶液可以排查。

（5）色谱柱过载：选择高容量的色谱柱或降低进样浓度。

鬼峰：

主要来源于溶剂污染（包括流动相、稀释剂等）、色谱柱污染、进样器污染、气泡、配样污染（移液、定容等过程）、上针残留等，如鬼峰出现在空白溶液，且多针重现，可通过进空针、更换洗针液、更换色谱柱、更换仪器、重配流动相等筛选引起鬼峰位置；如鬼峰出现在样品溶液中，可能是上针残留、气泡、及配样污染。

总结

在高效液相色谱仪的使用过程中，必须养成良好的实验习惯，对仪器使用过程的各种参数及时记录，这是故障排查的参考依据，严格按照SOP要求使用、维护仪器，在遇到故障时单因素排查，快速找出故障原因并解决，提高仪器的使用寿命及使用效率。