1.HPLC色谱分离模式的选择

在建立化合物的HPLC方法时，可以首先根据化合物的分子量大小，极性大小及PKa，选择合适的分离模式，在适当的分离模式下去再去优化同类的色谱柱及流动相。化合物分子量<2000Da时，可根据图1来选择：

图1 分子量<2000Da的分离模式

化合物分子量>2000Da时，可按图2来选择

图2分子量>2000Da的分离模式

2.反相键合相色谱柱性能影响因素

对于大部分小分子化合物来说都可以选择键合相的反相色谱，下面先分析反相键合相色谱柱性能的影响因素，只有了解影响色谱柱性能的因素，才能结合目标分析物的性质、需要达到的分析效果及实验室条件来选择适合的色谱柱。

2.1 影响色谱柱性能的物理参数：

⑴硅胶纯度

硅胶纯度和残留金属离子浓度，硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，发生拖尾。

⑵色谱柱尺寸

填料床的长度和内径，增加色谱柱长度，可以提高分辨率；宽柱径，提高载样量。

⑶颗粒形状及粒径

球型或不规则形，球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；平均颗粒直径，粒径越小，柱效越高，柱压也越高。粒径分布越广则柱效越低。

⑷颗粒表面积

颗粒外表面和内部孔表面的总和，以m2/g表示，相对而言高表面积对样品具有较强的保留能力，更大的柱容量和分离度。而低表面积能更快达到平衡状态，更适合梯度洗脱程序。

⑸孔径

颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是80~300Å，大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，改善分离，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子。

2.2 影响色谱柱性能的化学因素

⑴键合类型及键合相

键合相分子与基体单点相连为单体键合，这种键合方式可以提高传质速率，缩短柱平衡时间，聚合体键合为键合相分子与基体多点相连，这种建和方式可以增加色谱柱稳定性，增加载样量；键合相不同会直接影响化合物的保留行为。

⑵碳覆盖率

高碳覆盖率可以提高分辨率和重现性，但分析时间长。

图 3高低碳覆盖率

⑶封端

硅胶键合相填料中有部分未封端的残留硅羟基，如图封端可以减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应，改善保留和峰形，这对于碱性化合物尤其重要。

图4 硅胶键合相填料

3.反相键合相色谱柱的选择

3.1 重现国标文献中方法

选择色谱柱粒径、比表面积、基质表面特性、键合类型等相似的色谱柱，或者利用USP网站及一些色谱柱选择软件，如“column selector for acd/chemsketch”来查询相似系数。选择相似系数高的色谱柱。 

3.2 建立新化合物分离分析方法的色谱柱选择

根据目标分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分离要求、仪器、成本等各方面来选择色谱柱。

⑴粒径（1.7μm、3μm、5μm等），根据分析时间要求（粒径小，分析速度快）、灵敏度、仪器（粒径越小，压力越高）、价格等来选择

⑵比表面积，高比表面积有助于分离，低比表面积更适合梯度洗脱程序

⑶孔径，大分子化合物适合大孔径，在保证比表面积的前提下，选择孔径大的。

⑷键合相的选择

下图是常见的化学键合相及其运用范围。

图5 化学键合相的类型及其应用范围