概述
醛类化合物（结构见图1）是医药行业中常见的起始原料，例如甲醛是抗菌药盐酸四环素、抗血小板药氯吡格雷重要的合成原料；用于生产甲硝唑等药物的中间体2-甲基咪唑用到乙醛和乙二醛作为起始原料。醛类化合物也是多种医药产品的合成中间体，如邻硝基苯甲醛作为有机合成中间体用于制造抗心绞痛药物硝基吡啶（心痛定）；3-噻吩甲醛是杀菌剂、雄性激素抑制剂等药物的重要中间体；3，4-二甲氧基苯甲醛是合成抗过敏药曲尼司特、降压药哌唑嗪的中间体。另外，药包材及辅料中存在的醛类化合物也不容忽视，比如口服液体药用聚酯瓶在生产过程中，可能产生乙醛；长春西汀注射液中的辅料维生素C降解和苯甲醇氧化后会产生微量的苯甲醛和糠醛；常用作生物注射剂稳定剂的聚山梨酯类辅料也可能含有不可忽视的甲醛、乙醛等。
图1.醛类化合物结构图
根据国际人用药物注册技术要求协调会（ICH）和欧洲药品质量管理局（EMA）的调查研究表明，醛类化合物均被列为潜在的基因毒性杂质，其中甲醛和乙醛已被世界卫生组织（WHO）确定为1级致癌物质，甲醛可引起哺乳动物细胞核基因突变、染色体损伤、断裂等，乙醛会直接破坏细胞DNA结构，诱发基因突变，甚至引起严重的染色体重排，对造血干细胞的影响尤为显著。醛类化合物由于其易挥发且不具有生色团的特性，给该类化合物分析方法的开发带来许多的难题。因此，探索建立快速、灵敏、准确、可靠的醛类化合物分析方法，从而严格控制药物和医药中间体中醛类化合物的含量是非常必要的。
根据参考各国药典及文献，总结了部分含有醛类基因毒杂质药物的种类，详见表1。
表1. 含有醛类基因毒杂质药物列表
常用的检测方法
直接检测法：
目前已知报道的醛类化合物的检测方法较多，大多采用常规的检测方法，如分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱（GC）、顶空气相色谱法（HS-GC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等。有文献报道，采用气相色谱法配置氢火焰离子化检测器（FID)，液体直接进样测定药物中间体2-甲基咪唑中乙醛的含量；或者采用顶空气相色谱法，外标法顶空自动进样，非极性弹性毛细管柱分离，测定注射用氨苄西林钠舒巴坦钠中乙醛、异丁醛的残留；也有文献显示，建立高效液相色谱法，以0.2 mol/L 乙酸铵-乙腈为流动相，可以实现长春西汀注射液中基因毒杂质苯甲醛和糠醛的含量测定；除常见的色谱法以外，也有人开发出毛细管电泳联用化学发光检测的方法，检测中药丹参注射剂和片剂中的3,4-二羟基苯甲醛。
衍生化法：
醛类化合物由于其易挥发且不具有生色团的特性而带来很多分析难题，尤其是甲醛、乙醛等小分子量化合物，极性大出峰早，在紫外检测器没有吸收，在火焰离子化检测仪的检测器中响应也不明显，因此衍生化方法在辅助醛类化合物的检测和分离的应用中较为常见。比如测定利尿药氢氯噻嗪中的甲醛含量时，可以使用乙醇作为衍生试剂，将甲醛衍生为二乙氧基甲烷进行检测；也有多篇文献报道，使用2,4-二硝基苯肼将甲醛衍生为甲醛2,4-二硝基苯腙，从而测定药物中甲醛的含量。比如采用柱前衍生液相色谱-质谱联用法测定氯吡格雷原料药中痕量甲醛残留，该方法经过2,4-二硝基苯肼衍生反应，反相色谱柱分离，质谱检测器检测（ESI源，负离子模式），完成测定；药用辅料中醛类基因毒性杂质衍生化法检测的应用也很常见，曾有文献报道过以邻- (2,3,4,5,6 -全氟苯基)羟基氨盐酸盐作为衍生化试剂，采用气相色谱-质谱联用法测定衍生产物从而实现30+种药用辅料如羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素中甲醛、乙醛、丙醛、苯甲醛等多种醛类化合物的定量。
案例
氯吡格雷：
氯吡格雷（Clopidogrel，化合物1，图2），是一种ADP受体阻滞剂，可与血小板膜表面二磷酸腺苷（ADP）受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板相互聚集。临床上主要用于动脉粥样硬化及冠状动脉综合征的治疗，也用于冠状动脉介入术治疗后血栓性并发症的预防。在氯吡格雷的合成过程中，合成中间体4步骤使用了甲醛作为反应原料（图2），有在成品中残留的风险。甲醛致癌性明确，并且会对人的神经系统、呼吸系统和肝脏产生较大毒性，应严格控制其在药物成品中的含量。
图2. 塞来昔布的合成工艺
该分析方法采用衍生后高效液相色谱-质谱联用法，以2,4-二硝基苯肼为衍生化试剂，在酸催化下和甲醛发生反应生成甲醛-2,4-二硝基苯腙，质谱使用ESI离子源，负离子模式，选择检测离子m/z=209.0，从而实现氯吡格雷中甲醛的检测。根据ICH指南的要求，对该方法进行了检测限（LOD）、线性、精密度、准确性等相关验证，甲醛在0.05 ~ 5.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2 = 0.9990，甲醛的LOD能够达到1.0×10-4 ppm，回收率范围为92.0% ~ 106.0%。本法灵敏、可靠、准确度高，可用于实际生产中甲醛残留的测定与质控，具有一定的应用价值。
氯霉素:
氯霉素（Chloramphenicol，化合物9，图3），是一种广谱抗生素，通过脂溶性可弥散进入细菌细胞内，主要作用于细菌70s核糖体的50s亚基，抑制转肽酶，使肽链的增长受阻，抑制了肽链的形成，从而阻止蛋白质的合成。临床用于治疗由伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、布氏杆菌、肺炎球菌等引起的感染。氯霉素的合成方法有对硝基苯乙酮法、苯乙烯法、肉桂醇法、对硝基苯甲醛法等，其中对硝基苯甲醛法即以对硝基苯甲醛（4-NBA，化合物10，图2）为起始原料，经过一系列反应后生成氯霉素，对硝基苯甲醛也是氯霉素的光降解产物之一。4-NBA经Ames试验证实具有致突变性，会引起DNA损伤，且结构中的芳香醛和芳香硝基也是潜在遗传毒性的警示官能团，因此有必要开发灵敏而快速的方法控制氯霉素中4-NBA的残留。根据ICH指导原则，结合氯霉素的服用周期，4-NBA的最大摄取量为120 μg/d，氯霉素的最大日用剂量为3 g，则对应的基因毒性杂质4-NBA的限度为40 ppm。
图3. 氯霉素合成工艺
因此，采用衍生后高效液相色谱-紫外检测方法测定氯霉素样品中4-NBA，以3-硝基苯肼盐酸盐为衍生试剂，可以最大程度的减少药物基质和衍生试剂的干扰。本方法通过实验设计，优化出最佳衍生化条件，即在60℃下与500 μg/mL的3-硝基苯肼盐酸盐在乙腈-水（70:30，v/v）中反应30分钟，得到合适的衍生物，HPLC-UV法测定衍生物以实现4-NBA的定量。根据ICH指南的要求，对该方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，4-NBA在0.03~0.3 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2 = 0.9994，4-NBA衍生物的LOD和LOQ分别能够达到0.009 μg/mL及0.03 μg/mL，回收率范围为97.8% ~ 112.1%，RSD平均值为1.42 %。本法灵敏、可靠，适合在痕量水平下对氯霉素中4-NBA进行控制，为氯霉素工艺过程控制和质量保障提供参考依据。
总结
基因毒性杂质分析是药物开发过程中极具挑战性的方面，需要在患者用药的安全性与研究周期、资源投入之间找到一个合适的平衡点，以便快速将药物推向市场。如本文所示，某一特定类型的基因毒性杂质通常可遵循其自身特性开发出多种分析方法。由于基因毒杂质低限度水平的分析需求，更复杂的仪器和样品制备过程变得更加普遍；与此同时，也更加需要知识经验丰富的熟练的分析化学家来操作这些复杂的方法并合理地分析数据。由此可见，只要药物的研发与生产不停发展，遗传毒性杂质分析的需求和发展也将永无止境。
