柱层析分离净化的实验技巧和方法

1　柱层析操作方法的选择

　　目前 ,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量 ,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结 ,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度 ,缩短样品的洗脱时间 ,是一种比较好的方法 ,与常压柱类似 ,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气 ,双连球或者小气泵等。

2　柱子规格的选择

　　市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～40倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。

3　装柱

　　柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 ,湿法省事 ,一般用淋洗剂溶解样品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶剂越少越好 ,不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 ,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢 ) ,并且一定要均匀 ,不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ,大多数情况下有些小气泡没太大的影响 ,因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。

4　溶剂的选择

      极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

　　选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、亲合性 (Affinity)和分离度 (Res oluti on)。溶剂应选择价廉、安全、环保的 ,可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高 ,乙醚很易挥发 ,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程 ,易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少 ,要依不同需要选择。另外值得一提的是 ,由于我们进行的是痕量分析 ,淋洗剂的纯度必须关注 ,一般使用农药残留级或 HPLC级的 ,如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用 ,一方面环保 ,另一方面也能节省部分经费。

5　上样

　　用少量的溶剂溶解样品加样 ,加完后将底端的活塞打开 ,待溶剂层下降至石英砂面时 ,再加少量的低极性溶剂 ,然后再打开活塞 ,如此两三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂 ,一开始不要加压 ,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 (2～4 cm) ,再加压 ,这样避免了溶剂 (如二氯甲烷等 )夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ,上样后在柱上又会析出 ,这一般都是比较大量的样品才会出现 ,是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,这样就必须用干法上柱了。

6　淋洗液的收集和浓缩

　　用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话 ,就不容易流出 ,这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液 ,由于使用了较多的溶剂 ,必须进行浓缩 ,如果待测物具有一定的挥发性 ,最好使用常压挥发溶剂 ,否则易导致检测结果偏低。

7  其他整理自网络的经验

装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 

湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。

上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量芗洗涤后，再加入。

湿法较方便，柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 

柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

接下来谈TLC，需要切记的是： 
第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。
第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。 
选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。我在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了所有的溶剂用来两两组合后，最后才找到petroleumether/THF这类不常见的混合溶剂。 
一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。
对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示：A X B C D
这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。
利用TLC判断物质的纯度时，往往要和NMR相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。但有趣的是，由于H NMR可鉴别的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。但是自己以前的样品，则可以只通过点板来判断纯度。

硅胶柱层析惯用方法

1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。
2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4.压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。
6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。
7.检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8.送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

注意事项
1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化
2.将柱子必须装平整、均匀
3.考虑有限柱填料的吸附量

4.可考虑用梯度法分开并洗脱

快速柱色谱(Flash Column Chromatography)是一种快速而且（通常是）容易的分离复杂混合物的方法。柱色谱和薄层色谱的原理一样，但它可以用于制备量物质的分离。因为我们是用压缩空气将溶剂推过柱子，故称其为快速柱色谱。这不仅使分离效果更好，并且可缩短过柱时间。

制备和操作快速柱色谱：

1）确定干燥、不含溶剂的待分离混合物的重量。

2）用薄层色谱选取溶剂体系，使Rf的值处于0.2～0.3之间，但如果混合物复杂，这可能不现实。在比较复杂的情况下，可能需要借助梯度洗脱的方式，简单地说，就是在纯化洗脱的过程中不断提高溶剂的极性，该技术在后面有更加详尽的介绍。但是在薄层色谱分析中，你必需确定哪种溶剂体系将会使不同的点样处于Rf在0.2～0.3的范围之内。

3）确定用于样品上柱的方法。你可有三种选择：净试样法，溶液法或硅胶吸附法。

净试样法：如果样品是非粘性油状物，使用净试样法最为容易。你可以用一个长的滴管过滤器将液体引入柱中，然后用预先确定的溶剂体系进行淋洗，把所有组分洗入柱子中。

溶液法：净试样法有时可能会引起分离柱断层。因此，对于液体和固体，更为普遍的方法是将样品溶于溶剂中，然后将溶液加入分离柱。最理想的状态是，混合物中所有组分在该溶剂体系（通常是戊烷或己烷）中的Rf为0。这在多数情况下是难以实现的，所以可选用那种只移动混合物中一个化合物的溶剂，或者你可以简单地用所选择的洗脱液。记住：后面两种选择对于难度较大的分离纯化是有风险的。

硅胶吸附法：最后一个技术是将化合物沉积（吸附）到硅胶上，这对部分液体和所有固体都是有用的。注意：硅胶是酸性的，因此这一步骤将会破坏一些对酸敏感的化合物，它们通常需要在硅胶柱上再生。首先，在一圆底烧瓶中将混合物溶解在二氯甲烷中，加入硅胶（硅胶的质量大约是化合物质量的两倍）。在旋转蒸发仪上浓缩该溶液。注意：硅胶是非常细的粉末，很容易被吸入旋转蒸发仪中。用玻璃毛塞住接头或泵的保护装置，以防止固体被吸入泵中。快速转动亦可以避免这个问题的出现。当固体基本上干燥的时候（当多数固体从容器壁上脱落，说明固体已经干燥），从旋转蒸发仪上卸下烧瓶，再用真空泵将溶剂抽尽（假设混合物中没有易挥发性物质）。注意：用玻璃毛塞住真空泵接头，否则你可能会发现硅胶（以及你的化合物）进入真空管并沉积在那里。一旦其完全干燥之后（固体中再没有气泡产生），从真空系统中取下烧瓶，用干净的刮刀从壁上刮下固体。现在，你可以简单地用粉末漏斗将这部份固体加到分离柱的顶端，然后用洗脱液淋洗（每次1.5mL）。【简单了说就是硅胶拌样时，防爆球口塞上棉花之类的东西，要不产品就会随着硅基进水泵了】

4）确定合适的硅胶和化合物的比例。对于简单的分离，通常要求两者的比例为30~50：1（重量比）；但对比较困难的分离，需要的比例高达120：1。和一些经验丰富的同事进行讨论，将对你解决这个难题大有裨益。

5) 选取合适的分离柱。你所需用的硅胶量决定了分离柱的尺寸。是使用短而粗还是长而细的分离柱，迄今为止还没有定论。我们认为短而粗的分离柱会有更好的分离效果，但是这个结论可能会被你以后的一些同事所质疑。当你首次开始实验的时候，最好的选柱方法是向实验室的同事了解：对给定的硅胶量，应选择怎样的分离柱！把结论记在笔记本上（这比测量分离柱的直径方便很多）。

6) 选取合适的收集用试管。这也是一个向有经验的同事们请教的好机会。但也有简单的方法：将硅胶体积除以4，然后选取能装下这个体积的试管就可以了。（200mL的硅胶对应于50mL的组分）

7) 一旦你选定了分离柱，你需要堵住活塞底端以避免硅胶的流失。通常，用一小团棉花或者玻璃毛加一根长棍或玻璃棒即可完成。【现在都是用磨砂底的硅胶柱，直接可以用了】

8) 在通风橱中填充分离柱。考虑到要用大量挥发性溶剂，以及干燥硅胶对于健康的危害，不允许在通风橱外进行柱的操作。检查并确定柱子是否完全垂直，倾斜的柱子不利于分离。

9）关上活塞并且加上几英寸高的洗脱液。

10) 用漏斗向分离柱中加入一些沙（干燥并且经过洗涤的）。目的是在塞堵物上铺一薄层砂（不超过1cm），这样可以避免硅胶落入收集瓶中。

11) 量取合适量的硅胶，最安全的方式是在通风橱中量取。硅胶的密度大约是0.5 g/mL，因此可以直接用锥形瓶量取（100g＝200mL）。不要让硅胶的体积超过烧瓶的1/3，因为我们还要在其中加入溶剂。

12) 在刚量取的硅胶中加入至少1.5倍体积的溶剂，将其制成浆状，用力振荡和强烈搅拌，使其充分混合，并且除去硅胶中的气体（气泡的存在将会使分离柱的效率大打折扣）。

13) 用粉末漏斗小心缓慢地将浆状物移入分离柱中，注意不要破坏下面的沙层。注意在灌浆的过程中不时地停下来并且摇动浆体，以确保硅胶混合均匀。灌浆结束后，用洗脱液反复冲洗烧瓶几次，并且将余下的溶剂硅胶混合物加入到分离柱中。

14) 用滴管和洗脱液将黏附在柱子顶部边缘上的硅胶冲洗到溶剂层中。

15) 当所有的硅胶都被洗离柱壁，打开活塞，用压缩空气给柱加压。柱内的硅胶将会压缩到原来高度的一半左右。检查以确保柱子的顶段平坦，如果不平，必需重新搅拌，然后沉降下来。在加压下，加入过量的洗脱液，用铅笔头或橡皮塞轻轻地从敲打柱子，这将使硅胶颗粒填充得更加紧密。收集从柱子中流出的所有洗脱液，在加入化合物之后重复使用。

【注意：切记不要让溶剂液面低于填充层。】

16）当柱子填充好以后，在硅胶的顶部加入沙子作为保护层。沙层需要填充的比较平整，厚度约在2cm左右。这在添加溶剂时起到保护柱子的作用——当溶剂加入过快时，如果没有沙层的保护，溶剂可能会破坏填充硅胶的平整的表面（因此影响分离效果）。

17）在溶剂还没有达到沙层之前，可以用压缩空气促使溶液层下降。

18）关闭活塞，将第一个试管放在柱子的出口下面。

19）小心地向分离柱中加入你的化合物——当添加液体时，确保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的顶段。当冲洗含有混合物的烧瓶时，小心地一次性地将满满一滴管淋洗液加到分离柱中。然后打开活塞，当液体下降到填充物的顶段时关掉活塞。如此冲洗烧瓶三次。对沉积在硅胶上的混合物，还要再加2cm厚的保护沙层。

20）小心地在分离柱中加满洗脱液。开始时可以用巴斯德球管加入溶剂。当加入了1cm高度的溶剂之后，最好打开活塞。继续用滴管滴加溶剂，直到溶剂高于柱内的填充层几个厘米。现在，可以通过一个粉末漏斗从锥形瓶中加入溶剂了——缓慢地让它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破坏柱内填充物的顶段。

21）当把洗脱液装满分离柱之后，你就可以开始“过柱”了。请记住快的流速将使分离更好地进行。调整空气压力使达到一个快的流速——但不能象消防笼头那么快！保持压力，在收集试管装满后换上一支新的试管。注意随时向柱内补充溶剂。

22) 用TCL跟踪柱子的分离进程。一边收集样品，一边进行薄层色谱分析。这一点可能带来一些忙乱，因此，你若要观察色谱柱工作进展情况，则在一开始便可以减低气压（甚至完全去除）。

23）当操作梯度洗脱时，先用一种溶剂以保证具有较大Rf的化合物先从柱中被洗脱。当他们被安全地洗脱到收集烧瓶之后，便可以更换一种极性更大的溶剂继续洗脱。注意：逐步提高溶剂的极性。过于急速的极性变换可能会使硅胶分裂——就像电影里可怕的地震场面一样，柱内的填充层出现裂缝。这对你的分离将会非常不利！因此，以每100mL（或更多）溶剂中增加5％左右的极性，直至达到所希望的溶剂。然后，用该种洗脱液洗脱，直到目标化合物被洗脱出来。这个时候，你可以继续更换洗脱液或者直接进行下一步。

24）当你确定所有目标化合物都已经从柱内被洗脱的时候，你就可以将每样东西收拾起来了。首先，在分离柱的底端放置一个大烧瓶，然后用一个夹子切断联通分离柱的压缩气体的气路。让气体将剩余的溶剂全部压出柱子，然后干燥硅胶（从分离柱中移出硅胶比较困难，除非它是完全干燥的）。对于大的分离柱，这个过程差不多要耗费一个小时。

25）当分离柱在干燥之时，可开始将组分合并起来。用薄层色谱来确定哪个试管中含有所需的纯样品。将相似纯度的组分合并放在大的圆底烧瓶中，并用旋转蒸发仪进行浓缩。对于费时较长的柱子，可在柱分离过程中就合并流出的组分，以加速进程。

26）当完全除去溶剂后，就可以用NMR分析所得到的化合物了。