强制降解通常涉及将药物暴露于高热、高湿度和光照环境之下以模拟药物极端环境下稳定性研究。对于溶液状态下的研究，药物还需要在一定范围的pH值下进行试验。然后将产生的实验样品用于证明所提出的分析方法是“药物稳定性研究的指示”，即该方法能够检测活性成分含量的损失以及随后降解产物的增加。理想情况下，应通过单一分析方法监测活性成分含量的减少和降解产物的增加。但是，在某些情况下，这是不可能的，必须开发单独的测定方法和杂质检测方法。本文介绍了如何使用强迫降解研究来开发稳定性研究的指示方法。

监管指南概述

各种国际准则中都描述了强制降解研究。人用药品注册技术国际协调会议（International Conference on Harmonization，ICH）已发布了一套准则，这些准则已由美国、欧洲和日本的监管机构讨论同意并采用。在大多数情况下，ICH准则仅适用于新产品的应用，即不适用于临床开发。但是，由于用于强制降解的条件仅是笼统的定义，因此有可能将其应用于临床开发过程中开发稳定性指示方法。然后可以在开发和商业化过程中将相同的强制降解条件应用于药品稳定性的研究。

（1）ICH Q1A –新药和产品的稳定性测试

（2）ICH Q1B –新药物和产品的光稳定性测试

（3）ICH Q2B –分析方法程序的验证

在ICH Q1A第2.1.2节（压力测试）中，建议了对原液和成品药品进行强制降解研究的条件。建议检查温度（高于加速测试的温度，即> 50°C），湿度（相对湿度≥75％），氧化和光解的影响。溶液中的测试也应在很宽的pH范围内以溶液或悬浮液形式进行。然后将这些样品用于开发稳定性指示方法。

ICH Q1B提供了推荐的方法来评估药物原液和成品药品的光稳定性。强制降解条件在第二部分（药品）和第三部分（药品）中指定。虽然可以定义强制降解研究的暴露水平，但可以高于确认性（稳定性）测试的暴露水平。光稳定性研究的实际设计留给申请人；但是，如果在短时间内终止曝光研究，例如观察到过度降解，则需要科学依据。可以在固体或溶液/悬浮液中进行光稳定性测试。然后将这些样品用于开发稳定性指示方法。

指南Q1A和Q1B均指出，在强制降解研究过程中形成的某些降解产物可能实际上未观察到在稳定性研究过程中形成，在这种情况下，无需进一步检查。

ICH Q2B提供了有关如何验证分析方法的指南，并且在B节1.2.2（无杂质）中建议使用强制降解研究的样品来证明特异性。特异性是确定分析方法是否为稳定性指示的关键因素。保留在色谱柱上的峰或组分的共洗脱将低估形成的降解产物的数量，并可能损害质量并增加患者的风险。

选择适当的实验条件

文献中有许多进行强制降解研究的实验条件的例子，药物分子的结构多样性使得不可能为强制降解研究指定通用的条件。

对于早期研究的药物，首先要使用一组标准条件是有必要的，因为关于药物内在稳定性可能知之甚少。如果可获得早期稳定性数据，表明该分子在特定条件下（例如高pH）不稳定，则可以修改条件以考虑不稳定性（例如降低的温度或研究时间）。一旦找到一组条件，在开发过程中每当需要一种新的稳定性指示方法时，都可以重复这些条件。因此，对于后期分子，强制降解条件由早期工作来具体研究决定。通过在整个开发过程中重复使用相同的强制降级条件，可以保持一致的检测方法。

ICH指南未提供有关强制降解研究中需要降解多少的任何指导。如果施加的压力太小，可能不会观察到某些降解途径，这不会挑战该方法在稳定性测试过程中检测和监测降解产物的能力。如果施加的压力太大，则可能会观察到不切实际的降解产物，并且所得的分析方法可能不适合检测稳定性测试过程中形成的实际降解产物。因此，需要仔细选择实际条件，以使在强制降解过程中产生的原液的降解量既不过分也不会太少。下面的示例演示了使用过度强制降级条件的后果。将化合物A与盐酸混合，观察到一种降解产物化合物B（见下图1）。开发了一种指示稳定性的方法来检测这种潜在的降解产物。然而，随后对该药物的研究表明，化合物B实际上是次要降解产物，并且首先形成了化合物C。使用的分析方法无法检测化合物C，因此必须开发新的稳定性指示方法以监测药物原液和成品的稳定性。化合物B不被认为是实际的降解产物，因此不再需要开发能够检测其的方法。

图1.化合物A的潜在降解途径

对强制降解文献的调查表明，不同工人实现的强制降解水平差异很大。但是，从科学上讲，限制降解的数量是合理的，因为这应该使形成初级降解产物的机会最大化。通过分析多个时间点上的强制降解样品，可以监视是否形成了次级降解产物。如果观察到原始降解峰减少并出现新峰，则表明原始降解产物正在降解。对于大多数原液和成品，主要降解产物是在稳定性测试期间可能会观察到的那些降解产物。

化合物D正在降解，最初观察到一种相对降解时间（RRT）为0.68的主要降解产物（见下图2）。在稍后的时间点，RRT 0.68的水平下降，形成了两个新的降解产物，分别为RRT 0.08和RRT 0.09（见下图3）。这表明主要降解产物RRT 0.68是不稳定的，并且在长时间的应力作用下会形成次要降解产物RRT 0.08和RRT 0.09。

图2.第一个时间点后化合物D的HPLC色谱图

图3.第二个时间点后化合物D的HPLC色谱图

带有质谱检测的HPLC（LC-MS）可以提供有关降解导致的结构变化的有价值的信息，这有助于解释降解途径。下表1显示了一些通常观察到的质量变化。

表1.强迫降解研究中观察到的常见质量变化

多次添加氧或水分流失可能表明二次降解产物的形成。如果怀疑是这种情况，则应重复进行强制降解研究，但应使用较温和的条件和/或较短的压力时间。

许多药物的水溶性差 ，需要添加有机助溶剂才能保持溶解性。溶液样品更易于处理，可以提高分析测试的准确性。ICH Q1A并未具体说明强制降解研究所需的解决方案，在适当的情况下允许使用悬浮液。但是，混悬液的降解速度往往比溶液慢，并且通常需要对整个样品瓶进行分析，以减少与对悬液进行二次采样相关的误差。助溶剂的使用可以防止所有这些问题，但是，有机助溶剂的使用可能导致以下情况： 

（1）降解率提高或降低

（2）原辅料与药物之间的反应产物

（3）有机助溶剂

（4）有机助溶剂在色谱图中产生的峰

乙腈（MeCN）和二甲基亚砜（DMSO）是两种广泛使用的有机助溶剂，在大多数情况下，它们应适用于强制降解研究。但是，据报道某些助溶剂的分解可能会在某些条件下发生，因此其他类型的助溶剂可能更合适。通常的建议是使用尽可能少的有机助溶剂，以最大程度地减少影响。与助溶剂的反应可能会产生副产物，这些副产物可能被误认为降解产物。因此，不建议将醇（例如甲醇）用作强制降解研究的助溶剂。甲醇有可能与许多官能团反应（见下图4），形成新化合物，这些化合物可能被误认为是潜在的降解产物。

图4.可能与甲醇反应的官能团

强制降解研究与稳定性数据之间建立联系

与在稳定性测试期间观察到的降解产物相比，强制降解的药物有可能形成更多的降解产物。但是，这样可以最大程度地减少未检测到稳定性测试过程中形成的实际降解产物的可能性。因此，如果已经进行了适当的强制降解研究，则该方法可被视为稳定性指示。在这种情况下，观察到的降解产物不存在表明该药物在储存条件下对降解稳定，而不是该方法无法检测降解产物。

强制降解研究的结果也可以用于研究药物在储存过程中的降解机理。反过来，这种理解可以用来定义适当的包装，以最小化或消除药物的降解。

在一系列典型条件下，化合物E被降解（见下图5），形成许多潜在的降解产物。其中，在稳定性测试研究中仅观察到两种降解产物RRT 1.16和RRT 1.35形成。

图5.化合物E的强制降解汇总

对于化合物E，在使用指定的控制措施– RRT 1.16和RRT 1.35进行存储时，在加速或实时稳定性测试期间仅在原料药中检测到了在强制降解研究中观察到的两种降解产物。但是，事实证明，HPLC方法能够检测到强制降解研究中所有可能的降解产物，并且适用于监测化合物E的稳定性。

结论

强制降解研究是开发稳定性指示方法的重要组成部分。涉及许多方面，需要使用良好的科学判断和知识，以确保产生的强制降解样品包含实际的一级降解产物。与加速或实时稳定性试验中实际观察到的相比，很有可能观察到更多的强迫降解产物。如果遵循这些标准，则分析方法具有最大的潜力来检测在加速或实时稳定性测试中形成的实际降解产物。因此，没有观察到的降解产物可以归因于原料药的稳定性而不是分析方法上的不足。

参考：

1、International Conference on Harmonisation; http://www.ich.org/products/guidelines.

2、ICH Harmonised Tripartite Guideline Q1A (R2), Stability Testing of New Drug Substances and Products, February 2003.

3、ICH Harmonised Tripartite Guideline Q1B, Stability Testing: Photostability Testing of New Drug Substances and Products, November 1996.

4、ICH Harmonised Tripartite Guideline Q2 (R1), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, November 2005.

5、Alsante K.M., Martin L. and Baertschi S., “A Stress Testing Benchmarking Study”, Pharm. Technol., 2003, 27(2), 60-72.