病毒清除是生物制药产品病毒安全性的基本方面。世界各地的监管机构要求生物制药企业适当地隔离其制造过程，以减轻来自生产工艺步骤或产品批次的残留污染以及同一工厂生产的产品之间交叉污染的风险。法规在定义“适当”时含糊不清，使生物制药企业可以解释监管要求并定义自己的除病毒工艺和隔离策略。考虑到制造工艺和容纳此类操作的设施之间的差异，因此看到不同企业采用了一系列隔离策略也就不足为奇了。

在此，我们提供了一系列可操作的病毒隔离策略，在设计生物制药设施时可以考虑这些策略。也讨论了在许多多系统中使用的CIP系统造成交叉污染的可能性。

单克隆抗体（MAb）已被证明是治疗多种疾病的有价值的生物药物。这些复杂的分子通常由重组哺乳动物细胞系产生，例如在培养物中表达所选抗体的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。许多这样的细胞系表达逆转录病毒样颗粒（RVLP）。它们被分泌到培养基中，被认为是与过程有关的杂质。

当前的法规指南要求从最终的纯化MAb产品中去除RVLP，其功效与感染性病毒相类似。根据ICH Q5A文件，对除病毒能力的要求是：“整个纯化过程应能够消除比单剂量未处理样品中估计存在的病毒还要多的病毒”。指南也提供了一个示例，说明如何计算有关每剂生物制药产品潜在RVLP的安全阈值，以每剂估计颗粒（EPD）表示。

该计算的结果是每10剂中有一个可能的颗粒，该限量现已被认为是RVLP去除的最小目标。RVLP可以是传染性的，也可以是非传染性的，通常将鼠白血病病毒（MuLV）用作模型。

典型的单克隆抗体生产过程包括将中间样品的pH降低至3.6-3.7的步骤。这种弱酸性条件对许多包膜病毒（包括MuLV）具有很强的灭活作用，因此对减少病毒有重要作用。但是，该过程对变化非常敏感：在pH大于3.8时，失活会明显减少，在pH小于3.6时会形成聚集体。

病毒灭活过程通常在搅拌槽中进行，在搅拌槽中控制pH，保持时间和温度。将pH值调整到所需的酸性值后，工艺员会在指定的温度下将罐中的内容物孵育指定的时间，以实现有效的病毒灭活。之后，将溶液中和，并根据需要进行下一步处理的调整。

在灭活过程中，重要的是批次中的所有材料必须在指定的持续时间内达到目标pH值。否则，某些材料可能会将仍然活跃的RVLP携带到下游（残留），从而损害了所需的病毒减少率。残留物来源包括：

1、使用不正确或者不清洁的传输线

2、灭活前后使用相同的设备

3、可能重新进入工艺流程的飞溅物或气溶胶的产生

4、容器的死角区域（例如，采样端口，仪器端口和喷嘴）中存在液体。

生物制药生产商通过实施双容器设计减轻了这些风险：在第一个容器中降低过程溶液的pH，并将其内容物转移到第二个容器中进行孵育。这样可确保第二个容器中的所有材料都已达到所需要的pH。

这得到企业和监管机构的公认，在包括ICH Q7在内的许多监管指南中都解决了残留污染病毒清除的风险：“应采取适当的预防措施，以防止病毒从病毒前到病毒后的去除/灭活步骤的潜在病毒污染。” 适当的预防措施一词值得进一步检查。残留物对病毒清除的影响可以使用一个简单的数学模型来计算。这样的计算对于定量表征多少残留物会损害特定步骤（例如低pH保持）中的病毒清除率很有用。基于此类计算，可以评估是否已采取“适当的预防措施”以防止残留，否则会损害病毒清除率。重要的是要注意，这种计算仅在没有病毒传播的情况下才有意义（例如，无宿主细胞的下游操作）。

下面，我们展示一个示例，说明如何在MAb纯化过程中将数学计算与低pH灭活步骤的失效模式和效果分析（FMEA）结合使用。如果使用其他类型的化学灭活剂（例如，溶剂/洗涤剂），则可以使用相同的考虑因素来处理残留。

工艺说明

在典型的下游工艺中，首先通过蛋白A色谱介质结合来捕获MAb。然后用低pH洗脱缓冲液从该捕获柱上洗脱MAb。洗脱后，将洗脱液的pH调节至3.6–3.7，然后保持一小时。通过中和溶液的pH来终止低pH灭活步骤，以准备后续的纯化步骤，例如离子交换色谱（IEC）。图1显示了可用于低pH值病毒灭活步骤的一次性容器和传统的多次使用容器。

图1：用于低pH值病毒灭活的设备示例；（上图）带有集成搅拌器的一次性袋子系统；（下图）一个典型的不锈钢罐，其中显示了常见的配件，例如入口，出口，套管等。

当使用多用途容器时，蛋白A柱的洗脱液通过靠近容器壁的入口管或J管（图1中的“浸入管”）小心地输送到病毒灭活容器中，从而最大程度地减少了泡沫，防止喷溅。在滴定过程中，将容器中的物料连续混合以确保均匀（通常在灭活期间内）。通常的保持时间为一小时后，将低pH值的溶液中和，并准备进行后续纯化。在孵育过程中，将监控温度和pH，以确保有效地灭活病毒。现代技术允许完整的灭活过程在封闭过程中执行，包括所有转移，监测，混合，取样和滴定步骤。

为了我们的目的，我们假设一个模型，其中灭活步骤（Vbefore）之前的蛋白A洗脱液体积为400L，低pH灭活步骤（RFlab）的MuLV还原因子为5log。

临界潜在残留量计算

基于科学家提出的数学模型。可以计算出可能影响像上述容器那样在低pH值步骤中失活的潜在残留物（VCo）的体积：

VCo = 400L÷10 5 =4mL

因此，如果将>4 mL的灭活前溶液转入灭活后溶液中，则会损害低pH步骤的病毒还原，从而影响药物产品的安全水平（RVLP/剂量）。如果4mL在槽中某个地方没有通过低pH处理（例如，如果pH保持在3.8以上），并且没有转移“ MAB”溶液的距离更远，则可能发生这种现象。

失效模式对病毒清除的影响

我们关注的与灭活前和灭活后材料之间的过程分离相关的失灵模式不包括关键的病毒失活参数，例如pH，温度，混合和缓冲液制备。在有效的过程隔离中（与房间隔离相反），所有灭活后的物质均已从非灭活溶液中成功分离出来。接下来是对灭活过程中不同元素的系统评价，以及与这些元素相关的分离失败的可能性。注意，下面提到的大多数生物处理设备要素在美国机械工程师协会（ASME BPE）的生物处理设备标准中进行了讨论。

储罐的入口管应足够宽，以使来自蛋白质A捕获步骤的所有洗脱液都转移到储罐中。如果使用狭窄的入口管，则某些洗脱液可能会残留在该管中（例如，通过毛细作用）。在保持期间或之后，此类物质可能会由于干扰而进入储罐。还应考虑在喷嘴，进液口（>1000 L的大型容器）或头法兰（<2000 L的容器），喷射装置，汲取管，顶部安装的搅拌器支架等中滞留流体的可能性。

图2：一次使用和传统的不锈钢多次使用容器剖面图描绘了典型组件，建议特别注意潜在的残留物。

小型移动式储罐通常将下部连接到顶部（图3）。通常，该组件不会浸入水中，因此在该区域可能会发生洗脱液的液体滞留量不会暴露于低pH值的情况。例如，如果焊接边缘（图3中标记为“ 6”）不完全光滑，则液体会进入并通过毛细作用保留。在病毒灭活后，在此之前或在O形环凹陷处或O形环凹陷处（图3中标记为“ 7”）捕获的任何未经处理的过程材料都可能重新进入过程流，从而危及病毒的安全性。缓解措施可包括确保未经处理的材料不会进入组装点，将储罐填充至该点以上，用pH值调节过的材料冲洗组件或重新设计储罐组件。

图3 ：（左）用于低pH值病毒灭活的小型移动水箱以红色圆圈显示了装配点。（右）上下箱部件之间的组装详细信息，突出显示（1）下法兰，（2）上法兰（3）O形圈密封，（4）组装螺栓，（5）垫圈， （6）每个法兰和水箱之间的焊接边缘，以及（7）组装的O形圈密封件。

出口阀：

完成低pH灭活后，将槽中的物料转移到下一个下游操作，这通常是色谱步骤。这种转移通常通过水箱底部的出口阀进行。这种阀门的设计可能对病毒的安全性产生深远的影响。

图4左侧的阀设计为无袋形结构。搅拌槽时，隔膜上方的容积也将与槽中的物料有效混合。相比之下，在图4右侧的设计示例中，将阀门放置在出口管道上，从而在混合罐和阀门之间产生较小的滞留体积。即使罐中内容物的剧烈混合也不大可能确保与该死腿区域的内容物充分混合。因此，这种袋中的材料可以逃脱灭活。这样一个口袋的容量很容易达到几毫升。由于其位置，当罐中的物料被转移到下一个制造工艺步骤时，这种材料肯定会在中和后向下游移动。

图4：出口阀设计实例；（左）阀膜片放置在靠近罐腔的位置；（右）阀在水箱和隔膜之间有死角区域。对于后者，停滞的液体有可能逃脱低pH值病毒灭活条件的高风险。

如果无法消除这种凹坑，则一种可能的缓解措施是将调节后的单克隆抗体溶液通过出口再循环，然后通过入口再循环回储罐。这将消除袋效应，并确保所有MAb溶液都能达到目标酸度。另一个缓解方法是使用在线pH调节，从而确保所有进入储罐（及其容器）的材料都经过pH调节，并且所有病毒均被灭活。因此，可以使用图4中所示的两种出口设计，但是可能需要采取其他措施来减轻滞留形成的风险。

侧彼附件：

当使用钢制储罐时，生物制药工艺工程师会选择其尺寸，以确保最小的顶部空间，从而确保最小的非浸没表面积。一定量的水可以坐在水箱的上侧壁，盖子，喷球或液体表面上方的其他区域，并且该物质可以逃脱病毒的灭活作用。如果此类材料在低pH处理后重新进入过程流，则未灭活的病毒将重新引入溶液中。根据储罐设计的不同，此体积可能足够大以损害病毒清除能力。使用工作量较小的大型水箱会出现最坏的情况。因此，应适当考虑此故障模式。

温度和pH探针：

正确的温度和pH值对于确保有效的病毒灭活都很重要。因此，在孵育过程中会连续测量两个参数。通常，两个探针在孵育过程中都永久安装，并保持与过程材料接触。不应有不会达到目标pH和/或温度的相关口袋。图5a和5b描绘了不同的热套管设计。应当仔细考虑容器壁和法兰之间的距离，以及套管和放置套管的直径。我们必须确保所有液体混合正确。注意，类似的考虑也适用于所有安装件，即使未使用的安装件也是如此。

图5a：使用标准法兰设计（左）或焊接设计（右）的不锈钢罐中热套管的典型侧壁安装选项，可消除潜在的死角区域。

图5b：使用NA Connect接头（NovAseptic）进行混合的仪器端口，没有液体区域停滞。如果设计或安装不正确，则其他设计也会产生死角区域。

一种不同的方法是在t=0时使用相同的pH探针，然后在孵育期结束时验证正确的pH。在这种情况下，操作人员应确保在培养结束时，不会将电极表面的任何物质（从t=0开始测量）重新引入水箱。

这些示例用于说明有关侧壁附件（例如温度或pH传感器）的残留风险的一些相关考虑因素。它们只是例子。每台设备均需进行详细检查。尽管热套管和其他端口对于正常操作是必需的，但此类元件还具有通过产生死角区域而损害病毒安全性的潜力。

人员：

操作员经常执行手动物料转移和pH调节。因此，预灭活材料受到相关污染（例如手套污染），然后在灭活后与工艺流接触，因此构成了一种故障模式，该模式可能使某些材料无法通过低pH处理。手套被足够的材料污染以致无法隔离的可能性很小；但是，可以通过确保在灭活前和灭活后接触（“工作服”）之间更换手套，或通过使用无菌连接器（而非法兰连接器）来最大程度地减少接触，来轻松解决这种故障模式。

气雾剂：

如果在低pH调节之前产生气雾剂，那么在整个病毒灭活期间，此类飞沫可能会在制造工厂中持续存在。中和过程溶液后，气溶胶滴可能重新进入过程流，并将潜在的未灭活病毒带入下游过程。然而，气溶胶携带的体积太低，以至于对低pH步骤的病毒灭活效果没有任何实际影响。因此，在这种情况下，pH灭活后此类气雾剂进入后调节罐应无实际问题。

正确的设计是关键

在两个阶段的评估中，我们使用了数学工具来确定病毒灭活过程对残留物的敏感程度。然后，我们在第二阶段使用该模型的结果，使用FMEA来确定可能导致与病毒安全性相关的工艺材料残留的条件。我们以前使用相同的模型来研究在制造过程的多个阶段使用单个CIP撬块期间的残留。

因此，我们使用数学模型将注意力集中在那些对低pH病毒灭活有最大影响的失效模式上。我们的模型可以区分哪些风险是实际的，哪些需要考虑，哪些没有实际的重要性。这些知识可以指导设备和过程设计，以充分减轻遗留风险。

得出的结论始终取决于为模型研究选择的特定条件-在这种情况下，对400 L的体积进行了5对数灭活。使用我们的数学模型，可以轻松解决其他条件。例如，如果已证明7对数灭活，那么将应用更小的残留量，“口袋形成”的重要性（例如，一个例子）大大增加，并且（另一个例子）可能需要缓解以防止气溶胶生成。在整个纯化过程中具有过量的累积清除率可补偿本文所述单个步骤的轻微（潜在）病毒还原失败。这些其他步骤可能对结转敏感的程度必须单独评估。

我们的数学模型可以成为评估病毒隔离的易于理解的工具。它可以为数据驱动的设施，过程和设备设计评估提供框架。或者它可以用来指导流程步骤执行以消除故障模式。通过其简单性，该模型可以帮助确保将努力放在最大效果的地方，从而在设备，设施和过程设计期间支持成本效益。

鼓励员工参与此类讨论，除了使所有参与者对关键问题和不关键问题有实际的了解之外，还可以有助于更好地了解谨慎的隔离做法的必要性。保持有效的隔离不仅取决于设施设计和程序，还取决于对隔离的关键性的彻底理解和对故障模式的理解，如本文所述。

请注意，我们仅解决了pH灭活步骤本身。此处未考虑进出其他制造步骤的进出（例如，预捕获材料的进入或病毒过滤后可能进入过程的材料的释放）。我们的示例仅涉及pH值步骤，但是原理可以轻松调整，并应用于其他类型的纯化步骤，甚至可以评估在同一设施内执行的一系列步骤的分离。重要的是要整体考虑生物制造过程，同时分别评估每个步骤。例如，pH失活过程中产生的气溶胶对于特定步骤可能不是问题，但是如果它们进入更下游的过程（例如，病毒过滤后），它们可能会严重危害病毒清除。

可以通过不同的措施来减轻本文所述的潜在设计缺陷的风险，例如对储罐或附件设计进行更改，在转移至储罐的过程中在线调节pH值，使用如上所述的两容器配置，甚至进行连续处理。但是，也应仔细检查此类过程的可能故障模式，并进行如上所述的类似分析。一些故障模式将消失，一些故障模式将保留，并可能出现新的故障模式。

显而易见的是，所有设备元件的正确设计对于防止残留和导致无法将未处理材料与处理过的处理材料隔离是至关重要的。符合适当的设计标准（例如ASME BPE）将使您朝着这个目标走很长的路。但是，设计标准没有包含用于确定给定残留量的临界度的定量工具。

所有设施和程序都互不相同，我们在此介绍的要素必须适应个别设施中的特定条件。但是，一般原理保持不变，并且使用一种系统化的方法（如我们目前提出的方法）可以帮助生物制药开发商在下游过程中的低pH灭活步骤中实现足够的分离。

文章来源：

1、ICH Q5A(R1). Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin. US Fed. Reg. 63(185) 1998: 51074; https://database.ich.org/sites/default/files/Q5A%28R1%29%20Guideline_0.pdf.

2、ICH Q7. Good Manufacturing Practice Guidance for Active Pharmaceutical Ingredients. US Fed Reg. 66(186) 2001: 49028-49029; https://database.ich.org/sites/default/files/Q7%20Guideline.pdf.