本研究旨在制备具有骨诱导及抗菌双重功能的多孔支架。我们首先是通过基因工程技术构建多西环素（DOX）控制BMP2表达的骨前体细胞，再生物3D打印含活细胞的支架。支架可缓释DOX并杀灭定植细菌，防止感染的发生；BMP2的控制表达可诱导细胞的成骨分化和裸鼠体内异位成骨，并防止BMP2过度表达的不利效应。

01、研究内容简介

严重创伤、骨肿瘤等临床上常见疾病均可导致大段骨缺损的发生并有较高的感染风险，对其的治疗仍是骨科临床的重大挑战。生物材料在骨缺损修复领域的应用已有广泛的研究，如何兼顾骨再生和控制感染的双重需求，是近年来众多研究关注的热点。3D生物打印技术在支架制备方面具备显著的优势，而基因工程技术可实现生长因子基因给药的目的，避免其直接应用所带来的诸多限制。

如图1所示（Fig.1），本研究利用基因工程和3D生物打印技术相结合，制备了双功能支架：利用慢病毒转染技术，将Tet-on系统控制表达的BMP2基因转染入C3H10T1/2细胞中，使细胞可在DOX的刺激下，诱导性表达BMP2；在生物3D打印时，先通过高温打印挤出负载有DOX的介孔生物玻璃（MBG）与PCL的混合物，再将上述基因工程细胞负载于生物墨水中，通过低温打印构建与PCL/MBG/DOX的交错结构。支架通过缓释的DOX，同时实现骨诱导和抗感染功能；即DOX一方面刺激支架中负载的基因工程细胞表达并分泌BMP2，另一方面作为广谱抗生素发挥较好的抗菌性能。

Fig. 1 The 3D-bioprinted scaffold with cells exhibiting DOX-controlled BMP2 expression. a) Construction of the transfected cells that can express BMP2 based on the Tet-on expression control system, and fabrication of 3D bioprinting scaffold that contains composite of PCL/MBG/DOX and engineering cells within the bioink. b) Mechanisms of antibacterial properties and BMP2 controlled release ability of the bioprinting dual-functional scaffold.

该基因工程细胞携带红色荧光（RFP）报告基因，因此我们先利用激光共聚焦显微镜（CLSM）观察不同时间点细胞在支架中的存活情况。支架制备后的第1天，即可见在支架的生物墨水区域有大量的RFP信号，证明本研究采用的高温打印与低温打印交错的打印方式，仍可保证细胞在打印过程中的存活。支架在体外培养21天后，仍可见大量的RFP信号，表明细胞在支架内可长时间存活；且原来无细胞的PCL/MBG区域，也可见大量RFP信号，提示细胞在支架内部增殖并迁移（Fig. 2）。支架与细菌共培养研究也表明，含DOX组支架可显著抑制表面的MRSA粘附，同时保证支架内部细胞在感染环境下较好存活。

Fig. 2 Survival and proliferation of transfected C3H20T1/2 cells on the scaffold. Confocal microscopy images showing RFP-labeled cells in the scaffold on days 1 (a) and 21 (b).

本研究还通过Elisa实验证明了支架中的细胞在DOX刺激下表达并分泌BMP2（Fig. 3d）。再利用Transwell小室，将支架与BMSCs共培养，并通过ALP染色及茜素红染色，证明了支架良好的诱导成骨分化能力（Fig. 3）。后续的裸鼠皮下异位成骨模型也证明，该支架在体内具备较好的骨诱导能力。

Fig. 3 Effect of the bioprinted scaffolds on osteogenic differentiation of BMSCs. a) ALP staining after 7 and 14 days of culture. The OM group contained only osteogenic supplements. b) Alizarin Red staining after 21 days of co-culture. c) Quantitative analysis of Alizarin Red staining. d) BMP2 secretion from scaffolds according to ELISA. **p < 0.01.

研究证实该支架同样具有良好的抗菌性。将生物荧光标记细菌Xen29在小鼠皮下支架中接种，并通过小动物活体成像系统(IVIS Lumina III)观察局部的感染进展情况。下图可见，相较于对照组支架，含DOX的生物打印支架具有更强的杀菌效果，感染局部荧光细菌的信号强度明显减弱（Fig. 4）。

Fig. 4 The antibacterial activity of the bioprinted scaffolds in nude mice. a) In vivo imaging of bioluminescent signals of bacteria at days 1 and 3 after implantation, respectively. b) Quantitative analysis and comparison of bioluminescence intensity. c) Culture of bacteria released from each scaffold. *p < 0.05.

本研究的结果，证明了基因工程技术和3D生物打印技术的巧妙结合在多功能骨修复支架制备领域具有广阔的应用前景。在后续的研究中，我们计划进一步探究自体BMSCs细胞在此材料体系的应用，并进一步在原位感染性骨缺损动物模型进行验证，为最终的临床转化研究提供更坚实的实验基础。

原文信息

Minqi Wang#, Hanjun Li#, Yiqi Yang, Kai Yuan, Feng Zhou, Haibei Liu, Qinghui Zhou, Shengbing Yang*, Tingting Tang* . 

A 3D-bioprinted scaffold with doxycycline-controlled BMP2-expressing cells for inducing bone regeneration and inhibiting bacterial infection. 

Bioactive Materials 6(2021) 1318-1329.