摘要  目的：建立活血止痛类中成药中微量元素分析和砷形态分析测定的方法，为中成药中的质量评价积累数据，为活血止痛类中成药的风险防控提供数据支持。方法：采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定了6种活血止痛类中成药中的16种微量元素的含量；采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)测定了6种活血止痛类中成药中的6种砷形态的含量。结果：Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al在0.1～1.0mg·L-1范围内线性关系良好，Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As在0.2～2.0 mg·L-1范围内线性关系良好，标准曲线相关系数r均≥ 0.9997，加标回收率范围为91.6%～97.2%，RSD<7.3%；6种砷形态在1.01～20.02ng·mL-1范围内线性关系良好，标准曲线的相关系数r均≥0.999 8，检测限(LOD)在0.0101～0.326ng·mL-1之间，加标回收率为93.8%～98.7%，RSD<3.12%。骨折挫伤胶囊中的砷甜菜碱和砷胆碱含量最高，各为3.696 mg·kg-1和2.910mg·kg-1，五价砷含量为0.391 mg·kg-1，腰痛片中的砷形态测定结果为砷胆碱为0.476 mg·kg-1和砷甜菜碱为3.205mg·kg-1，其余品种微量检出或者未检出6种砷形态的含量。结论：经初步方法学验证，该测定方法可用于活血止痛类中成药中的微量元素含量测定和砷形态的测定，可用于该类药物的质量控制。

 

关键词：活血止痛；电感耦合等离子体质谱；微量元素；砷形态

 

目前市面上活血止痛类的中成药种类繁多，组成成份不一致，由不同的中药材通过不同的加工而成，其中中成药中的化学类成份研究很多，但对于其中的微量元素研究相对于少一点。随着现在的分析技术越来越先进，中药的成份研究也越来越深入，微量元素的研究更成为了热点，并且对于一些有害元素，不仅仅是从元素含量的总量进行评估，还要从元素形态上进行分析。本次研究选择了6种活血止痛类中成药，该类药品含有丰富的微量元素，其中有些元素是人体必须的元素，是人体生长代谢、身体调控机能的重要元素，比如Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Ba、 Mg、Se、K、Mn、Al，但有些元素是有害元素，比如Ni、Cr、As、Cd、Pb等元素，这些元素如果超标，将会对人体产生损害，危害人的身体健康。

 

目前元素测定方法有电感耦合等离子体原子发射光谱法、氢化物原子荧光光谱法、石墨炉原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。本文采用ICP-MS的方法测定16种微量元素的含量，ICP-MS具有检测灵敏度高，检测范围广，检测速度快等优点。

 

本文建立了6种活血止痛类中成药中Na、Ca、Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As、Se、K、Cd、 Pb、Al共16种微量元素含量测定研究方法，从元素总量上总体评价活血止痛类中成药的质量，根据测定结果发现有些中成药中总砷的含量偏高，于是进行了砷形态的分析，目前发现的砷形态主要有6种，分别为砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三价砷(AsIII)、五价砷(AsV)，其中三价砷和五价砷是毒性最大的砷，一甲基砷和二甲基砷的毒性较弱，还有砷甜菜碱和砷胆碱是没有毒性的。为了科学的评估活血止痛类中成药中的砷毒性，确定其安全含量范围，也有必要对6种砷形态进行分析。

 

1 、 仪器与材料

 

1.1  仪器

 

赛默飞ICP-RQ型电感耦合等离子体质谱仪、Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪，梅特勒电子天平。

 

色谱柱为Dionex IonPac™ AS7型阴离子交换树脂柱(4 mm×250 mm)，常州国华SHA-C型恒温振荡器。

 

1.2  材料

 

氩气(纯度＞99.999%，南京特种气体有限公司)，浓硝酸(优级纯，德国Merk公司)，碳酸铵(优级纯，国药集团)，水为超纯水，砷甜菜碱(批号1904)购自于中国计量科学研究院，砷胆碱(批号，1909)、一甲基砷(批号1902)、二甲基砷(批号1909)均购自中国计量科学研究院，亚砷酸盐As(Ⅲ)(批号144014-7)、砷酸盐As(Ⅴ)(批号976236-2)美国O2Si smart solutions。

 

砷单元素标准溶液(批号175385-28)美国O2Si smart solutions，Na、Ca、K、Al、Cu、Mn、Mg、Cd、Zn、Fe、Ba、Se、Pb、As、Cr、Ni无机混合标准溶液(批号：15111)购自中国计量科学研究院，黄芪标准物质GBW10028购自于国家质量监督检疫。

 

实验室测定用的6种活血止痛类中成药均购自于药店，分别为伤科接骨片、腰痛片、骨刺宁片、止痛化徵胶囊、骨折挫伤胶囊、腰痛宁胶囊。

 

2  、电感耦合等离子体质谱法测定微量元素

 

2.1  样品前处理

 

精密称取样品约0.5g，置聚四氟乙烯材料的微波消解罐中，加硝酸5mL，密闭并消解。消解采用程序升温，20 ℃升温至120℃，保持5 min；120 ℃升温至150 ℃，保持5 min；150℃升温至180 ℃，保持20 min。消解完全后，冷却至低于60 ℃，取出消解罐，放冷，赶酸，将赶酸后的溶液转移至50 mL的量瓶中，用少量超纯水分次洗涤消解罐5次，合并至量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。同时制备空白溶液，除样品外，其余同供试品溶液制备。

 

2.2  仪器测定条件

 

等离子体功率1550W，载气为高纯的氩气；载气流速1.0 L·min-1；采样深度：5mm；冷却气流量：14L·min-1；辅助气流量：0.8L·min-1；载气流量：0.9 L·min-1；重复3次采集数据。

 

2.3  标准溶液的配制

 

精密量取无机混合标准溶液(批号：15111)适量，用2%的硝酸溶液稀释，制成Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al质量浓度均分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg·L-1，含Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As质量浓度均分别为0.2、0.4、0.8、1.0、2.0mg·L-1的系列混合标准溶液。

 

2.4  标准曲线和方法检出限

 

取“2.3”项下系列混合标准溶液适量，按“2.2”项下条件进样测定，以各元素的质量浓度为横坐标(X)、光谱响应值为纵坐标(Y)绘制各元素的标准曲线。Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al、Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As、Pb等16种金属元素检测线性范围为良好，r均≥0.999 5。取10个空白溶液测定空白强度值，按照空白值的3倍标准差计算检出限(LOD)。结果见表1。

 

表1  各元素的线性关系考察结果

 

2.5  回收率及重复性试验

 

分别精密称取已知微量元素含量的骨折挫伤胶囊0.5g，各6份，加入一定量的混合标准溶液中，按“2.1”项下方法制备样品溶液，制得加样回收溶液，测定含量并计算回收率。结果，16种元素的平均回收率为91.6%～97.2%，因样品中Na、Se、Cd含量低于检测限，故方法重复性由回收率RSD表示，结果见表2。

 

2.6  精密度考察

 

取多元素混合标准溶液，按“2.1”和“2.2”项下试验条件连续测定6次，计算精密度。结果各元素响应值的RSD均在0.31%～0.85%内，说明该仪器精密度良好。

 

2.7  准确度考察

 

取适量的黄芪标准物质GBW10028作为质控样品，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，再按“2.1”和“2.2”项下条件进样测定，记录响应值。根据质控样品测定结果显示，16种元素的测定结果均在标准值范围内，表明本试验所用仪器测定的准确度较好。

 

2.8  微量元素含量测定结果

 

称取样品各0.5 g，按“2.1”项下方法进行处理后，按“2.2”项下条件进行测定。结果见表3。

 

表2  加样回收率结果

表3  各样品中微量元素含量(n＝3)

 

由测定结果可以得出骨折挫伤胶囊中总砷的含量比较高，因此本文还对6种中成药中砷形态进行了含量测定研究。

 

3、  砷形态测定

 

3.1  HPLC-ICP-MS测定条件

 

等离子体功率1550W，载气为高纯的氩气；载气流速1.0 L·min-1；采样深度为5mm；冷却气流量为14L·min-1；辅助气流量为0.8L·min-1；载气流量为0.9 L·min-1；重复3次采集数据。采用AS7阴离子交换柱(4.0mm×250mm)，以10 mmol·L-1碳酸铵为流动相A，200mmol·L-1碳酸铵为流动相B，流速为1.0 mL·min-1，进样体积为20 μL，梯度洗脱程序见表4，记录离子流图，见图1，A是6种砷形态对照图谱，B是骨折挫伤胶囊按“3.2”项下处理后进样的图谱。

表4  流动相梯度洗脱程序

A.6种形态砷标准溶液(The mixstandard solution of six kind of arsenic species)  B. 骨折挫伤胶囊样品溶液(The samplesolution of Fracture Contusion Capsules) 1. AsB；  2. DMA；  3. As(Ⅲ)；  4. AsC；  5. MMA；  6. As(V)

图1  离子流图

 

3.2  样品前处理

 

将样品干燥后粉碎均匀，过20目药筛，精密称取样品粉末0.25g，置于100 mL的具塞锥形瓶中，加入人工肠液20mL，超声15min，放置过夜。次日放入90 ℃烘箱中提取3h，每隔0.5h振摇锥形瓶1min。提取完毕，吸取中层滤液10mL，用微孔滤膜过滤，取续滤液5 mL，再用0.02mol·L-1的乙二胺四醋酸二钠(EDTA)溶液稀释至50mL量瓶中。将该溶液作为砷形态样品测定，同时制备空白溶液。

 

3.3  线性及检测限、定量限、线性范围测定结果

 

用超纯水逐级稀释制备6个浓度梯度的混合标准溶液。混合标准溶液中，亚砷酸盐的质量浓度分别为0、1.04、2.08、4.16、8.33、16.7、20.82μg·L-1；砷酸盐的质量浓度分别为0、1.01、2.01、4.02、8.05、16.10、20.12μg·L-1；一甲基砷的质量浓度分别为0、1.00、2.00、4.00、8.01、16.02、20.02μg·L-1；二甲基砷的质量浓度分别为：0、1.00、2.01、4.02、8.03、16.06、20.08μg·L-1；砷甜菜碱的质量浓度分别为：0、1.02、2.04、4.08、8.15、16.30、20.38μg·L-1；砷胆碱的质量浓度分别为：0、1.00、2.01、4.02、8.04、16.08、20.10μg·L-1。取混合标准溶液逐级稀释，稀释至总离子流色谱图中各形态色谱峰的信噪比(S/N) 下降约为3左右的浓度为该形态的检出限(LOD)，各形态色谱峰的信噪比(S/N) 下降约为10左右的浓度为该形态的定量限(LOQ)。实验得出6种砷形态的检出限、定量限。

 

表5  6种砷形态的线性、检出限、定量限及线性范围

3.4  精密度

 

用骨折挫伤胶囊研究测定该方法的精密度、稳定性和加标回收率。对该提取液连续进样6 次，结果一甲基砷、二甲基砷、三价砷和砷胆碱这四种砷形态未检出，计算得到砷甜菜碱、五价砷的RSD(n＝6)分别为1.01%和2.12%，均小于4%，结果表明该方法精密度良好。

 

3.5  重复性

 

精密称取骨折挫伤胶囊6 份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下条件测定，计算6份供试品的含量结果的RSD值均<5%，符合砷形态分析要求。

表6  6种砷形态重复性测定结果(以As计)

 

3.6  稳定性

 

选取一份4 ℃保存的供试品溶液分别于第0、2、4、8h内测砷甜菜碱、五价砷的RSD(n＝4)，分别为0.97%和2.02%，其余砷形态均未检出，表明该样品在8h内稳定性良好。

 

3.7  回收率

 

精密量取已知含量的骨折挫伤胶囊样品0.5g，分别精密加入6种砷形态储备液1、3、5mL，混匀后测定，每份样品平行测定3份，回收率结果(表7)显示：6种砷形态的回收率都在93.8%～98.7%之间。结果表明该方法回收率良好。

 

3.8  样品测定结果

 

应用建立的方法对6种中成药中的砷形态进行含量测定，每个样品平行测定3次。结果见表8。

 

表7  6种砷形态的回收率实验结果(以As计)

表8  样品中6种形态分析结果(以As计，n＝6)

 

4、  讨论与分析

 

4.1  测定方法的选择

 

本文采用ICP-MS的方法测定了6种活血止痛类中成药中的16种微量元素，并进行了方法学验证，验证结果良好，适合于中成药中的元素含量测定，ICP-MS的方法具有可以同时测定多种元素的优势，并且灵敏度高。采用HPLC-ICP-MS对该类中成药还进行了6种砷形态含量的研究，6种砷形态的分离度良好，峰型也良好，采用碳酸铵作为流动相的添加剂，对峰型的测定具有很好的调节作用，本次采用的ICP-QR型号的电感耦合等离子体质谱仪，采样锥孔比较小，流动相里的碳酸铵不会残留在锥孔上，相比于《中国药典》2015年版中采用磷酸二氢铵，可以有效避免仪器损伤。

 

4.2  砷形态测定供试品溶液的处理方法选择

 

本文为了更好的反映活血止痛类中成药进入人体后，其中可溶性砷被人体吸收的情况，因此模拟人体胃肠道环境，采用人工肠液提取，更好的反映了砷在人体环境中的溶出量。前期研究了该类活血止痛胶囊在水、人工胃液和人工肠液中无机砷的溶出总量，发现在水和人工胃液中没有溶出量，因此本次处理提取溶液选择了人工肠液，并对提取温度、提取时间、提取方法进行了摸索，最后确定超声提取15 min，放置过夜。次日放入90 ℃烘箱中提取3h，每隔0.5h振摇锥形瓶1min。由于该类药物中无机砷含量比较低，采取了超声提取，方法简便，易操作，减少提取过程中砷含量的损失。

 

4.3  测定结果分析

 

从测定6种活血止痛类中成药中16种微量元素测定结果可以得出：①各类活血止痛药中的有益元素含量差别很大；其中有益元素Fe的含量以伤科接骨片和骨折挫伤胶囊含量最高，是因为处方中含有煅自然铜，样品处理后会含有大量的Fe元素。Ca含量以止痛化徵胶囊、骨折挫伤胶囊含量最高，因为这两类药的处方中含有炙鸡骨和猪骨，这两味药材中含有大量的Ca，有助于骨胳的生长。腰痛片和骨折挫伤胶囊中Mn元素也高于其它几类药品，锰主要存在于垂体、肝胰脏和骨的粒线体中，为多种酶的组成部分。②有害元素Cd在各样品中均未检出，骨折挫伤胶囊中有害元素Pb、As含量明显高于其它药品，可能是因为该药的处方中含有大量猪骨，猪在饲养过程中可能因为有些饲料含有害重金属元素，然后在猪骨富集。③其中微量元素Se均未检出，伤科接骨片中重金属Ni的含量高于别的品种，Ni本身没有急性毒性，但是在体力合成羰基镍就很容易中毒。

 

从砷形态测定结果可以得出：①骨折挫伤胶囊中的砷甜菜碱和砷胆碱含量最高，各为3.696 mg·kg-1和2.910mg·kg-1，五价砷含量为0.391mg·kg-1，但是砷甜菜碱和砷胆碱是无毒的砷形态，五价砷含有毒；②腰痛片中的砷形态测定结果：砷胆碱为0.476mg·kg-1、砷甜菜碱为3.205mg·kg-1，这两种砷形态是无毒的，对人无太大伤害；③骨刺宁片和止痛化徵胶囊含有少量五价砷；伤科接骨片和腰痛宁胶囊中6种砷形态均未检出；④该测定结果与“2.9”项下的总砷测定结果一致，可以知道总砷大部分来源于这6种砷形态的总和，根据该测定结果，可以更加明确地知道药品中是含有有毒砷还是无毒砷。

 

虽然骨折挫伤胶囊中含有大量总砷，但是根据形态结果可以得出大部分砷为砷甜菜碱和砷胆碱，这两种砷形态对人体无害。

 

4.4  展望

 

本文先对样品进行微量元素测定，结果显示除了总砷的含量高以外，还有铬含量也很高，后期可以通过HPLC-ICP-MS对铬形态进行更进一步研究，更加明确是何种铬形态的含量高，更准确地控制中成药的质量。

 

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