本文以有关物质为例，以问答的形式引发读者思考，讨论杂质方法精密度与耐用性验证是否需要加标的问题。

首先澄清一下概念，加标的意思是在供试品中加入适量的杂质对照品，一般是为了使杂质含量在方法规定的限度附近。

问答环节

（1）有关物质方法验证是否需要研究未知杂质与总杂？

答：质量标准中关于有关物质的规定一般都有未知杂质与总杂的相关要求，即实际检测过程中需要报告未知杂质与总杂的检测结果，当然需要在方法验证中研究未知杂质与总杂，应当研究未知杂质与总杂的精密度与耐用性情况。

（2）加标后怎么做未知杂质与总杂的研究？

答：加入的杂质对照品会引入很多的未知杂质，甚至可能不是供试品中实际存在的未知杂质。加标样品的未知杂质数量多，且很可能不是实际可能的未知杂质，也就是说验证难度大意义小。

（3）是否需要在精密度与耐用性验证中研究杂质峰个数？加标后还可以进行相关验证吗？

答：需要，因为存在杂质个数不一致的风险，如同一供试品在不同仪器不同人员或者连续检测等情况下杂质峰个数不一致。为确认方法不存在该风险，应该研究杂质个数的精密度和耐用性。即在精密度与耐用性验证中应当证明检出的杂质峰个数没有变化。简单来说，不能一个样品测两次，一次检出2个杂质，一次检出5个杂质，这明显不合理。方法验证中需要说明方法检出杂质个数的一致性。

加标后引入了很多杂质对照品中的杂质，杂质峰个数难以统计，且不能代表真实的供试品中的杂质个数。

（4）如果供试品中已知杂质都是未检出，已知杂质的精密度怎么验证？

答：在回收率实验中为什么统计RSD，至少3个浓度各3个样品总计9个数据？就是为了说明供试品中如果存在已知杂质的检出结果的重复性。所以在精密度验证环节无需再次加标验证。

（5）为什么审评老师要求用中试以上规模的批次样品做方法验证？

答：中试以上规模批次的样品质量一般来说应该和大生产的产品质量相当，在有关物质领域杂质谱也应当是一致的。也就是说即使中试产品中已知杂质未检出或量非常少，用它验证的数据也可以用来预估大生产实际检测的情况。

方法学研究的目的最终是为了实际大生产服务，不是为了方法研究本身，所以不要纠结于中试样品中已知杂质未检出精密度验证数据是否可信等等。比如说某个已知杂质中试产品中6份样品都是未检出，精密度结果良好。大生产的样品该已知杂质的含量一般也应该是未检出，那么在实际QC工作中的检测结果也是可以重现的。或者即使是检出，也非常小，不影响对产品结果的判断，几乎不可能存在中试产品未检出而大生产期间该杂质超标的情况。题外话，我不能说这种可能性完全不存在，但不要拿这种低风险的事情来较真，我们研发要讲风险评估，不是要万无一失，这世上没有绝对的事情。凡事都拿小概率低风险说事，那什么问题也解决不了。

耐用性验证同上文的理念，中试样品足以验证；加标样品可以用来验证分离度，不必用来评价检测结果。

总结

方法是一个系统，包括了很多的环节，不能只聚焦于某个环节而忽略其他。以有关物质为例，系统适用性、已知杂质、未知杂质、总杂、杂质峰个数都是在实际检测工作中需要关注的内容，那么我们在验证方法的适用性时就不能只关注已知杂质，加标验证精密度和耐用性只能验证已知杂质的检测结果，其他环节无法判断。这样就会存在一种风险，比如实际检测工作中杂质峰个数随着色谱条件的微小变动而变动，但是验证中却没有发现，而方法验证的结果是符合要求。

撰写此文也是发现自从中国药典2015年版相关指导原则问世后，目前越来越多的人在用加标样品验证杂质检测的精密度和耐用性，因为不加标就不能满足药典的要求，但是我仍然觉得我们应当更加坚持真理，当然我的观点不能说是真理，我只是力图在逻辑上具有严谨性。