本文适用范围：主要针对采用高效液相色谱法进行含量含均的检查，气相色谱法和紫外-可见分光光谱法由于仪器不同，对结果的要求会有差异，试验内容基本相同。本文不适用容量法（滴定法）等其他方法。

一、含量方法学验证前的准备工作

1.开发准备

确保方法开发内容各项足够全面。即使方法学验证方案在时间上区分出了开发阶段和验证阶段，但在思路上，二者不该有明显的界限。一个新品种的分析方法，理应足够准确、灵敏和耐用，可以经过时间和无数批商业化批次样品的考验。开发与验证的全面性和灵活性缺一不可，分析工作或许会贯穿品种的整个生命周期。

2.物质准备

确定好方法学验证用样品，准备相关试剂、对照品、色谱柱等消耗品，确认所使用仪器都在校验有效期内，最后定稿方法学验证方案。——千百年来，兵马与粮草的关系，你们都懂的。

3.心理准备

准备好强大的内心，应对突如其来的偏差、真假难辨的误差、以及千奇百怪的各种问题。对业内人士来说，排名第一的内心独白是要淡定，排名第二的内心独白还是要淡定。

二、含量方法学验证内容

注：该表格为常规实验概述，特殊情况请自行增减内容。

下面分模块讲解各项试验内容：

1.专属性

1.1分离度考察试验

目的：考察空白溶剂、空白辅料和各杂质与待测组分峰之间的分离情况。

空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液：按拟定标准配制。

空白辅料溶液：空白辅料按处方比例混合后，按拟定标准配制。

各已知杂质定位溶液：没有明确规定，在配制浓度下杂质峰可见即可。勿配太大或太小，太大峰型过宽，不利于定位保留时间；太小在量程下看不到杂质峰，无法归属。

有时可配制杂质混合溶液，用来排除杂质干扰。再配制加入主成分（主成分待测浓度）和各杂质的混合溶液，确定主成分与相邻杂质的分离度——两针搞定，无需进针分析各杂质定位溶液。

1.2强制降解试验

目的：考察降解生成的杂质与主成分峰之间的分离情况，同时可以大致了解样品在各降解条件下的稳定性情况。

对于含量测定的强制降解试验，我们一般不需要知道降解所产生的杂质究竟是谁，只要确定降解杂质不影响主成分的测定即可。

同样的，主峰峰纯度也是要关注的。看主峰中是否包含其他组分峰。

降解试验条件要适度，降解程度尽量不低于80%，若条件足够剧烈，供试品仍未降解产生杂质，无需再提高降解条件的剧烈程度进行重复试验。

注意：若分析方法为等度洗脱，降解试验的采集时间应适当延长，避免降解产生的杂质未洗脱出来而影响下一针分析。

2.溶液稳定性

目的：考察对照品溶液和供试品溶液配制后的稳定时间，为工艺验证、批检验、稳定性考察以及上市后的含量测定提供依据。

系统适用性溶液视情况考察，对照品溶液与供试品溶液必须考察。

应先考察室温下的溶液稳定性，若不稳定，则应逐一排除，找出不稳定的原因（光、热、析出等原因），然后再重复考察避光条件或冷藏条件下是否稳定。若仍然不稳定，可考虑更换溶剂、更换流动相系统等方法。如无法解决样品不稳定的问题，则质量标准需规定供试品临用现配。

注意：溶液稳定性的考察时间也应针对具体情况，如采集时间较长，考察时间也应延长，目的是使后续检验更方便。

3.定量限

目的：为确保分析方法测定供试品含量的灵敏度。

定量限的概念：是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。

将对照品溶液逐级稀释，当稀释至信噪比约为10时，此时浓度可作为定量限浓度。

含量测定并不强制要求做检测限。

注意：定量限结果受色谱系统影响较大，如色谱柱、流动相、色谱仪的状态，甚至次日试验的结果会与前一天不同，在这种情况下，若定量限浓度较低，应换用色谱系统再次测定，以确保方法的灵敏度。

4.线性与范围

目的：在规定的浓度范围内，测定响应值（峰面积）与待测组分浓度呈比例关系的程度。

敲黑板——峰面积与浓度呈线性关系，是外标法的前提。

配制一份对照品母液，从中稀释配制成一系列不同浓度的线性溶液，至少制备5份（建议浓度点的总数为奇数），以测得的响应信号对待测物的浓度作图，检查是否呈良好的线性关系。

含量测定线性范围应至少为80%~120%或更宽，含量均匀度线性范围应至少为70%~130%或更宽，线性的浓度范围理应涵盖回收率考察的浓度范围，但注意浓度最低点应高于定量限浓度。

附一张推荐的数据结果表格与线性关系图如下：

5.精密度

5.1仪器精密度

目的：为保证仪器每次所测对照品溶液峰面积均一致，以确保含量测定结果的准确性，设计仪器精密度试验。

取对照品溶液，连续进样6次。考察保留时间和峰面积的RSD%。

5.2重复性

目的：考察六次取样测定所得结果之间的接近程度。

按照拟定标准配制空白溶剂、对照品溶液和6份供试品溶液（系统适用性溶液视情况配制），计算6份供试品溶液的含量，计算平均值并统计6份结果的RSD值。

2015年版中国药典关于重复性的可接受范围截图如下：     

5.3中间精密度

目的：考察在同一实验室，不同时间，由不同人员用不同设备测定结果之间的接近程度。

溶液配制与实验要求同重复性。

6.准确度

目的：考察采用拟定方法测定结果与真实值或参考值接近的程度，也叫做回收率试验。用至少测定6份结果进行评价，或设计3种不同浓度，每个浓度平行配制3份。

按照拟定质量标准配制空白溶剂、对照品溶液。

回收率供试品溶液：按处方比例混合的空白辅料+主成分对照品，再按照拟定质量标准配制溶液。

仅做含量测定，推荐浓度为80%、100%、120%。

做含量均匀度，推荐浓度为70%、100%、130%。

2015年版中国药典关于回收率的可接受范围截图如下：

7.耐用性

目的：考察色谱条件发生微小变化时对含量测定结果的影响。

按照拟定标准配制空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液（系统适用性溶液视情况配制），计算不同条件下供试品的含量测定结果，关注系统适用性是否符合标准要求（有时含量测定的方法中并不拟定配制系统适用性溶液，而是规定主峰理论板数和拖尾因子等，也要相应关注和统计。）。

同样放一张表格，将耐用性试验内容和结果要求直观呈现如下：

耐用性考察的内容可能还有很多，请各位根据实际情况增减。另外，有时几个条件同时变化的情况下是否耐用，也是需要考察的。但考察叠加条件工作量较大，可自行选择较为重要的条件进行考察。耐用性试验时，观察峰型和结果的变化趋势，后续检验一旦出现问题，可以通过现象推测偏差原因，及时解决问题。

注意：变化不同色谱条件时，切记根据需要延长采集时间。

做完以上这些内容，各项结果均合格，就可以皆大欢喜去转移方法了。如果哪一项出现问题，建议先进行复测（必要时，换人换仪器进行复测），先找出问题所在，再行调整方法。

三、总结和提示

1.目前药品研发企业对时间的观念可谓超强，申报时间延误不得，在这种大环境下，合理安排实验时间至关重要。每天实验之前多想想，是否有多个实验的对照品溶液是可共用的，是否有多个实验是可以同时开展进行的。统筹规划，可以为你节省很多时间和精力，以及，买对照品的钱。

2.有时容易被忽略掉的，是中间产品的含量测定方法。我们通常习惯于直接采用成品的含量测定方法进行中间产品的控制，然而总混颗粒跟片剂的性质仍然有差异，有时会出现方法并不适用的情况，比如中间产品重复性不好，比如研磨时出现吸附现象，比如有时成品含量测定称样量较大而中间产品则可相应减小称样量。在方法验证前期注意到这些细节，及时进行考察，避免测定时才发现问题，会更加被动。