本研究基于多层次仿生策略，优化了半月板源性生物墨水的制备，使其兼顾可打印性和细胞相容性。另外设计了定制的打印系统，将人工材料和生物墨水的优势很好的结合，进一步提高仿生水平。最后通过细胞活力、力学、生物降解和体内实验等，确保该支架具有足够的可行性和功能性，为其在组织工程中的应用提供可靠的依据。

01、研究内容简介

通过3D生物打印制备仿生支架是治疗受损半月板的有效方法。然而，由于半月板独特的解剖结构和复杂的应力环境，许多研究都采用了多种技术来充分利用不同的材料，如单纯3D打印，或与灌注结合，或与静电纺丝结合，来追求半月板的仿生，但这使得制备过程在一定程度上复杂化。一些研究人员试图仅通过3D生物成像来解决这一挑战，但打印材料和模型受到了明显的限制。本研究中基于多层仿生策略，优化了半月板源性生物墨水--甲基丙烯酸明胶(GelMA)/半月板细胞外基质(MECM)的制备，同时考虑其打印性和细胞相容性。随后，设计了一个定制的3 d生物打印系统--双喷嘴+ 多重温度系统，将聚已酸内酯(PCL)和半月板纤维软骨软骨细胞(MFCs)嵌入的GelMA / MECM 生物墨水的优势很好的结合，完成了仿生半月板支架的打印。最后通过细胞活力、力学、生物降解和体内组织形成等方面的研究，确保该支架具有足够的可行性和功能性，为其在组织工程领域的应用提供可靠的依据。

Fig 1. Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. The bioink was prepared by mixing ultrasonicated MECM, GelMA and MFCs at specific concentrations. Meanwhile, the sheep meniscus was scanned by CT, modeled in Mimics, and used to plan the printing path. The prepared bioink and PCL were printed under the designed printing parameters according to the established printing path, and finally, printing of the biomimetic meniscal scaffold was completed.

仿生半月板支架的打印经历了一个复杂的过程（Fig 1）。良好的微环境有利于半月板组织的再生。因此制备兼顾可打印性和细胞相容性的生物墨水是十分关键的一步。当前用于生物3D打印的生物墨水主要由天然聚合物组成，包括藻酸钠，明胶，胶原蛋白，壳聚糖，纤维蛋白，透明质酸和ECM等 。其中，ECM保留了大多数天然成分，去除了细胞免疫原性，是一种理想的生物材料。但是，由于ECM的成分复杂，不溶于水和有机溶剂，因此，难以打印。本研究开发了超声的方法，将ECM颗粒粒径减小且均一化，实现了ECM的可打印性。另外，该方法能够有效的调控材料的粒径并保证较小的破坏（Fig 2）。该研究还引入了明胶衍生物GelMA。两种材料按照特定浓度混合制备了可打印性和细胞相容性兼顾的半月板来源生物墨水（Fig 3）。

Fig 2. Characterization of printable MECM. (a) Effect of ultrasonication time on the particle size of MECM. (b) Effect of treatment method on the particle size of MECM. (c) Quantitative distribution of the particle size. (d) Gross observation. (e) SEM images (scale bar: 1 μm). (f) Type I collagen immunofluorescence images (scale bar: 500 mm). (g) Quantitative analysis of the collagen concentration (**P < 0.01, ***P < 0.001).

Fig 3. Cytocompatibility of the meniscus-derived bioink. (a) CCK-8 assays results of MFCs cocultured with different hydrogels for 1-7 days. (b) Comparative gene expression analysis for chondrogenic SOX9, COL1A2 and COL2A1 in GelMA and GelMA/MECM at 14days. (c) Immunofluorescence images showing the chondrogenic phenotype of MFCs in GelMA and GelMA/MECM constructs by COL type I staining (Green), cell nuclei (DAPI, blue) and F-actin (Rhodamine-phalloidin, red) (scale bar: 500μm).

生物墨水的流变特性对于优化打印参数至关重要。本研究充分表征了GelMA / MECM的流变学特性，发现该墨水具有良好的稳定性和一定的温敏性（Fig 4）。此外，这项研究表明，GelMA / MECM对温度较不敏感，具有明显的延迟性，需要超过30分钟才能达到稳定。由于在打印过程中组件之间的相互热干扰，GelMA / MECM的粘弹性可能存在一些波动，这些波动可能会影响打印的平滑性和细胞的活力。因此，在这项研究中，选择了电机驱动打印而非气动驱动打印。这样即使GelMA / MECM由于温度波动而表现出一定的粘弹性变化，也不会明显影响打印过程的平滑性。

Fig 4. Rheological characteristics and printability of the bioinks. (a-d) Rheological characteristics of the bioink: (a) Loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) at different angular frequencies. (b) Variation in viscosity with varying shear rate at the gelation temperature. (c) Gelation kinetics from 15°C to 37°C. (d) Variations in loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) from 37°C (T0) to a fixed temperature (T1, referring to legends). The above experiments were repeated in triplicate. GelMA/MECM’s transition of state from sol at 37°C (e) to gel at 20°C (f). (g) Printability of GelMA/MECM (scale bar: 1 cm). (h) GelMA/MECM hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). GelMA’s transition of state from sol at 37°C (i) to gel at 15°C (j). (k) Printability of GelMA (scale bar: 1 cm). (l) GelMA hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). (m) Spreading ratio of the bioinks (ns: P > 0.05).

多喷头打印技术极大地扩展了可以选择的材料范围，这有利于构建复杂的3D模型。但是，不同喷嘴和不同材料的配合仍然涉及许多细节。因此，探索每种材料的打印条件是必要的（Fig 5）。关于载有细胞的水凝胶的打印，生物墨水和细胞的类型均会对细胞活力造成一定的影响。在这项研究中，为确保高形状保真度和细胞活力（大于90％），需要反复调整包括GelMA / MECM浓度比，喷嘴的内径，打印温度和打印速度在内的各种参数。PCL的打印相对简单，要点仅包括打印温度和速度。这项研究中的最大挑战是如何很好地协调两个喷嘴和材料，以同时兼顾结构稳定性，细胞活力和所需的机械性能等。经过反复试验，最终确定以85°C为最佳PCL打印温度，并根据凝胶动力学确定了20°C的水凝胶打印温度。打印平台温度为20°C也是重要的条件，有助于防止GelMA / MECM凝胶由于交联前相对较高的室温而转变成溶液。否则，可能会破坏物质交换孔隙的形成。实际上，要解决整个过程中的关键问题，需要对材料和打印原理有充分的了解，并且这样的了解将有利于在不同领域中顺利创建多种定制模型。

Fig 5. Development of the biomimetic meniscal scaffold system. The primary model(a-d): the gross observations (a) (scale bar:1 cm), the microscopic images (b) (scale bar: 1 cm) and SEM images (c, d) (scale bar: 500 um) of the hydrogel scaffold ("GelMA/MECM" hydrogel, abbreviated as "hydrogel" in subsequent experiments), PCL scaffold and simple square scaffold from left to right. (e) Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. (f) Specific details of the meniscal model. (g) Actual diameter of the strands of the meniscal scaffold.

细胞活力和机械性能是用于验证该打印模型成功与否的初步标准。许多因素，包括生物墨水成分以及打印模型和参数，都会影响打印过程中的细胞活力。在本研究中，使用单喷嘴和双喷嘴打印进行细胞活力测试，然后在体外培养1天和14天。细胞活力超过90％（Fig 6）。此外，将水凝胶培养长达6周，细胞活力保持在90％以上。这些数据证明了该打印模型的可行性以及生物墨水的良好细胞相容性。

Fig 6. Cell viability after printing with a single nozzle (hydrogel+MFCs) and dual nozzles (PCL+hydrogel+MFCs). (a) Confocal images of two constructs after live-dead staining at two time points (scale bar: 500μm). The panoramic scanning (4×4) of the constructs printed by a single nozzle (b, black part was hole) and dualnozzles (c, black part was PCL) at 1 day (scale bar: 1mm). (d) Quantitative results for cell viability (*P < 0.05, ns: P > 0.05).

关于力学性能，本研究通过增加PCL单丝间距并减小PCL单丝直径以实现更好的力学仿生。最终，PCL单丝直径设置为500μm，间距设置为1000μm。支架的压缩模量为12.63 MPa，高于人类半月板的压缩模量（0.3–2 MPa）（Fig 7）。此外，受整体模型的限制，拉伸模量为24.86 MPa，在径向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，与周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在一定差异。而这种差异只能通过开发更合适的材料去解决。

Fig 7. Mechanical properties of the scaffolds printed by single nozzle and dual-nozzle. (a) Compressive stress-strain curve. (b) Compressive Young's modulus (**P < 0.01). (c) Tensile stress-strain curve. (d) Tensile Young's modulus (**P < 0.01).

缺损组织再生和支架降解之间的匹配对于支架在组织工程领域的应用十分重要。而本研究所用的材料在降解时间上存在一定的差异，因此研究者对不同的支架成分进行了针对性的实验设计。随着荧光成像技术的发展，可以以无创方式在体内连续监测水凝胶的变化，为评估水凝胶的生物降解提供了一种有效而可靠的方法。因此，首先研究者将嵌入细胞的水凝胶支架培养长达八周，以验证其基本稳定性。然后，在原位植入支架以评估PCL的生物降解，并在小鼠皮下植入Cy7标记的支架以通过体内成像监测水凝胶的降解。结果表明，支架中水凝胶的生物降解需要大约一个月的时间（Fig 8）。关于支架的原位降解，一些支架在3个月时开始出现损伤，而在6个月时仅可见这些支架的残骸。原因在分子量和纳米压痕测试的结果中（Fig 9）得到了很好的解释。支架的分子量在3个月时没有显着降低，但在6个月时有一定的降低，纳米压痕的测试也呈现出了类似的结果。这表明最初的微环境可能对支架的完整性影响很小，但随着时间的延长和分子量的降低，支架的强度逐渐减弱，从而大部分发生了降解。该结果表明，半月板的机械环境可能对支架的降解发挥了重要作用。

Fig 8. Quantitative fluorescence analysis of subcutaneous hydrogel degradation. (a) Variation in the fluorescence intensity of all specimens. The specimens in green circle cultured in PBS as control group. (b) Quantitative fluorescence analysis of three subcutaneous specimens from each group. (c) The process of surgical operation. (d) Dissection of the samples’ position after the fluorescence disappearance.

Fig 9. Analysis of the biodegradation of scaffolds in situ. (a) Gross view of the implant and femoral condyles (scale bar: 1 cm)，with the implants location shown in red circles . (b) Variation in the molecular weight of PCL. (c) Variation in the elastic modulus of PCL (****P < 0.0001). (d) Variation in the hardness of PCL (***P < 0.001). (e) Histological evaluation by collagen type I immunohistochemistry and picrosirius red (PR) and toluidine blue (TB) staining (scale bar: 500 mm).

裸鼠模型是观察组织工程软骨在体内形成的主要方法。无胸腺裸鼠的免疫系统降低，允许异种细胞的植入。因此，在本研究中，嵌入细胞的支架被植入裸鼠皮下，以分析纤维软骨组织的形成。结果表明，GelMA/MECM水凝胶和MFCs协助了类半月板组织的形成(Fig 10)。然而，由于裸鼠皮下微环境与人体半月板原生微环境存在明显差异，该支架还需要在大型动物实验中进行验证。

Fig 10. Preliminary evaluation of the regenerative effect of scaffolds in a nude mouse model (scale bar: 500 mm).

总体来说，本研究通过一个定制的双喷头 + 多重温控打印系统和半月板源性的生物墨水，充分集中了PCL和GelMA / MECM / MFCs的优势，实现类似于半月板的形态、力学、组分和微环境。并进行了各种针对性的验证，以确保该支架在组织工程领域中应用的可行性和有效性。然而，该支架在某些方面仍与天然半月板不同。PCL硬度高和柔韧性不足。MECM在脱细胞后失去其原始的物理性能，仅通过材料的逐层堆叠才能实现部分仿生，这与高度交联的半月板胶原纤维的环状排列不同。因此，材料科学和打印技术的改进可能是推动组织工程学发展的关键。当前，不同技术的结合对于实现半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。

02、论文第一/通讯作者简介

第一作者

周建：硕士，中国人民解放军总医院第四临床医学中心骨科研究所，研究方向为3D生物打印，半月板组织工程。

田壮：硕士，中国人民解放军总医院第四临床医学中心骨科研究所，研究方向为3D生物打印，半月板组织工程。

通讯作者

郭全义：主任医师/教授/博导，中国人民解放军总医院第四医学中心骨科研究所负责人。“十二五、十三五、十四五”及科技部“863”生物医药领域组织工程关键技术与系列产品研发主题项目首席专家。首届中华医学会再生医学分会副主任委员，中国医药技术协会骨组织库分会副主任委员，针对骨关节炎、关节退变、关节软骨损伤、股骨头坏死、骨科肿瘤等影响人类健康，难以医治的疾病进行了科研和临床研究，先后承担和参加了国家自然基金面上项目、重点项目、国家科技部领域项目（领域首席科学家）、“863”课题、“973”项目、科技部支撑计划、总后卫生部重点课题等攻关工作。先后发表国内外论文70余篇。多次参与可专业书籍的翻译和编写工作，在国际上首先把第四代组织工程软骨应用于关节软骨损伤的修复，为早期关节软骨损伤的患者带来了福音，将很大程度避免由于软骨损伤导致的关节置换手术。

唐佩福：主任医师/教授/博导，中国人民解放军总医院骨科分院院长，创伤病区行政主任。现任中国医师协会骨科分会常委，华裔骨科学术委员会理事，骨与关节损伤学术委员会委员，全军骨科学术委员会委员，中国致残委员会常委，中国康复学术委员会常委，，《中华创伤杂志》通讯编委，《中华中西医杂志》编委，《中华创伤骨科杂志》通讯编委，《实用骨科学》编委。曾获得国家自然科学基金、北京市自然科学基金和军队十一五课题等多项基金资助。长期致力于创伤的临床工作，并结合临床进行定向科研攻关，专业发展方向主要以骨质疏松性骨折、骨折微创治疗、髋臼骨折等治疗为重点，同时在四肢创伤、战伤救治、脊柱创伤、骨盆骨折、老年髋部损伤等领域进行了一系列研究。近三年来，以第一作者发表论文14篇，《EI》收录2篇。唐佩福教授长期致力于骨创伤与软组织损伤修复方面的基础研究及手术治疗方法的改进。在骨折治疗的BO理念指导下，于国内率先开展了骨折微创治疗的系列研究。由于术中不开放骨折端，不剥离骨膜，软组织损伤程度更小，因此充分保护了骨折局部的生物环境，是一种全新理念指导下的生物接骨术。此外，还开展了系列老年骨质疏松症的基础研究，探讨了调控成骨细胞与破骨细胞平衡的信号传导系统，发现P57小体和PLAD域等重要的细胞膜结构和启动基因，对老年骨质疏松症的启动和进展起到关键作用。

姚琦：主任医师/教授/博导，国家公派哈佛大学麻省总医院博士后，现任首都医科大学附属北京世纪坛医院骨关节科主任、中华医学会创伤分会青年委员会副主任委员，中华医学会北京骨科分会委员、中华医学会骨科分会创伤学组委员。长期致力于创伤骨科的临床工作，并结合临床进行科研攻关，专业发展方向主要以骨质疏松骨折、骨折微创治疗及骨科智能机器人为重点。首次利用原核表达系统成功制备出Sclerostin 蛋白，在获得分泌抗sost 单克隆抗体基础上, 利用RT-PCR 技术扩增了抗体可变区基因VH和VL, 组装成了单链抗体基因SOST-scFv, 并构建单链抗体原核表达载体SOST-scFv-22b, 对表达蛋白的活性进行初步研究, 为研究利用基因工程抗体治疗骨质疏松性疾病奠定基础。先后主持科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北京市自然科学基金等多项课题；以第一作者和通讯作者发表SCI文章20余篇，中文核心期刊论文20余篇；获得国家发明专利3项，参与编写《坎贝尔骨科手术学》。

03、资助信息

该研究得到了国家重点研发计划（2017YFC1103404）国家自然科学基（81872070）等项目的支持。

04、原文信息

Jian Z, Zhuang T, Qinyu T, Liqing P, Kun L, Xujiang L, Diaodiao W, Zhen Y, Shuangpeng J, Xiang S, Jingxiang H, Shuyun L, Libo H, Peifu T, Qi Y, Quanyi G. 

3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering. 

Bioact Mater. 2020 Nov 30;6(6):1711-1726.