我们将具有抗氧化、抗钙化及抗炎等多种生物学活性的天然产物原花青素（PC）与生物源性脱细胞支架材料猪小肠黏膜下层（SIS）通过交联反应制备PC-SIS修复补片材料。PC-SIS在体外呈现出良好的生物相容性及力学稳定性；兔膀胱全层缺损修复实验表明PC-SIS补片可有效促进膀胱平滑肌的再生，对于膀胱功能化重建意义重大。

01、研究内容简介

交联是提高材料力学性能及稳定性的常用工艺手段，对于SIS而言，交联可以通过表面修饰的方法扩大其应用范围。PC作为一种生物源性交联剂，具有抗氧化、抗钙化及抗炎等多种生物学功能，并且其代谢路径及生物安全性均已被验证。PC的酚羟基可以与胶原的酰胺羰基结合形成氢键，提高材料的力学稳定性。基于此，我们提出PC交联剂的引入可以提升SIS的生物学特性，并赋予其新功能，使其更符合临床对膀胱修复补片的要求。在本研究中，我们制备了不同交联浓度的补片材料，在体外评价了其生物学性能，并进一步探索其作为兔膀胱全层缺损补片的应用潜能。

该研究以SIS为基底材料，应用不同浓度的PC对其进行表面修饰及改性。为了筛选合适的交联剂浓度，在体外进行了交联度、力学性能及生物相容性等表征及评价，结果表明0.5mg/ml（PC-SIS 1）和1mg/ml（PC-SIS 2）既可以形成有效交联且具有良好的生物相容性 （Fig.1）。

Fig. 1 Optimal crosslinking concentration of PC in vitro. (A) Gross observation and ultrastructure of the material under a scanning electron microscope (SEM) of all groups. Scale bars = 100 μm. (B) Degree of crosslinking of PC-SIS as calculated based on the Ninhydrin assay. *P < 0.05. #P > 0.05. (C) Fourier transforms infrared spectral (FTIR) analysis. (D) Measurement of water contact angle of the materials with different concentration of crosslinker. *P < 0.05. (E) Characterization of the mechanical properties of various materials. *P < 0.05. #P > 0.05. (F) Cell proliferation in various groups as detected with a CCK-8 assay. Data was presented as mean ± S.D. *P < 0.05. #P > 0.05. (G) Viability of the cell on various materials as assessed by Calcein AM/PI staining. Scale bars = 50 μm. (H) Subcutaneous implantation of representative scaffolds 3 weeks postoperatively. ★Indicates scaffolds, →Indicates inflammatory cells. Scale bar = 50 μm.

我们进一步评价交联材料对膀胱平滑肌细胞的生物学特性的调控效应，我们将原代提取的膀胱平滑肌细胞接种于不同交联浓度的材料上，对其骨架形态、微观形貌及基因表达水平进行分析表征。细胞的表观及微观形貌表明PC-SIS材料更利于平滑肌细胞 “簇向” 生长，且维持平滑肌细胞功能的基因表达水平显著高于SIS组（Fig. 2）。

Fig. 2 Effect of crosslinking on R-B-SMCs. (A) F-actin staining showed the cytoskeleton on the different materials after 5 days culture. Scale bars = 50 μm. (B) SEM indicated the ultrastructure of R-B-SMCs on the different crosslinker materials after 5days culture. Scale bars = 5 μm & 10 μm. (C) Quantitative Real-Time PCR detected the smooth muscle-related gene expression on the different materials after 5 days culture. *P < 0.05.

为了进一步验证该新型活性生物材料在膀胱组织工程中的应用潜能，我们构建了占兔膀胱总面积1/3的全层缺损修复模型，并应用不同交联浓度的材料进行体内修复评价。术后3个月，取材后进行形态学及功能学评价，结果显示，修复区上皮组织均可实现连续再生，且上皮功能性标记物UPK-III在各组均有表达，相较于单纯SIS组，交联材料显著促进了平滑肌组织的再生。同时，修复区均可观察到血管及神经的再生（Fig. 3）。膀胱尿动力学功能评价表明PC-SIS能够显著增强膀胱顺应性（见链接原文）。

Fig. 3 Immunofluorescence staining and quantitative assessments of the repaired bladder domes in the sham and experimental groups at 12W after the surgery. (A) Expression of urothelial-associated markers AE1/AE3 and Uroplakin-III. UE, urothelium. Scale bars = 100 μm. (C) Expression of smooth muscle-specific markers α-SMA and Myosin. SM, smooth muscle. Scale bars = 100 μm. (E) The innervation marker, synaptophysin (SYP38). Arrows represented SYP38+. Scale bars = 50 μm. (G) The endothelial maker CD31. V denotes CD31+ vessels. Scale bars = 50 μm. Specific marker expression was indicated by red (Cy5 labeling) and DAPI staining (blue) marks the nucleus. (B, D & F) Percentage of positive area relative to total area are compared among the three groups. (B) AE1/AE3, (D) α-SMA, (F) SYP38 and (H) Number of CD31-positive vessels. Data was presented as the mean ± S.D. *P < 0.05; #P > 0.05.

PC-SIS材料具有良好的生物相容性、力学性能及抗钙化活性。在兔膀胱全层缺损模型中，PC-SIS补片能够有效促进平滑肌再生，改善膀胱顺应性，膀胱修复后功能评价显著优于SIS组，这种新型活性生物材料具有广阔的临床应用前景。期待该类生物材料可以得到深入的研究和开发，以推动动物源性脱细胞生物材料在组织修复领域的更大发展及应用。

02、论文第一/通讯作者简介

第一作者：张秀珍

四川大学生物治疗国家重点实验室博士，生物医学工程专业，研究方向：膀胱组织工程。

第一作者：江燕林

硕士，四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室助理实验师。主要从事脱细胞基质材料制备/干细胞原代培养/病理切片及染色/动物造模等。

通讯作者：解慧琪

医学博士，研究员，博导，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室主任，骨科研究所副所长。主要从事细胞外基质材料与组织再生修复研究及产品转化、成体干细胞与组织工程学研究，作为项目负责人主持完成20余项国家及省部科研项目，以第一/通讯作者发表论文60余篇。密切联系临床实际，专注研发具有自主知识产权的组织再生修复产品，以第一发明人申请国家发明专利30余项，授权20项，PCT专利2项。研究团队将研究成果成功进行产业转化，已有4项生物材料与组织工程产品获得国家Ⅲ类医疗器械产品注册证，已上市用于临床惠及100余万患者。目前尚有多个产品正在进行临床试验。

03、资助信息

该研究得到了国家重点研发计划项目（No. 2017YFC1104702）等的支持。

04、原文信息

Xiu-Zhen Zhang#, Yan-Lin Jiang#, Jun-Gen Hu, Long-Mei Zhao, Qiu-Zhu Chen, Yan Liang, Yi Zhang, Xiong-Xin Lei, Rui Wang, Yi Lei, Qing-Yi Zhang, Jesse Li-Ling, Hui-Qi Xie∗. 

Procyanidins-crosslinked small intestine submucosa: A bladder patch promotes smooth muscle regeneration and bladder function restoration in a rabbit model. 

Bioactive Materials 6 (2021)1827-1838.