由于不锈钢植入物的细胞相容性和机械抗性，它们是骨替代物的合适候选物，但是它们缺乏生物活性并且易于细菌感染。因此，为了克服这些限制，在这项研究中，我们通过电泳沉积(EPD)开发了一种创新的表面涂层，由(1)玉米蛋白 (2)生物活性玻璃和(3)含铜的生物活性玻璃，一种抗菌和促进血管生成的材料制成。

01、研究内容简介

骨科植入物的骨整合通过不同的步骤进行，从最初与体液的相互作用和现场炎症开始，然后是细胞层的形成和表面骨的最初产生及其随后的重塑。因此，在锚固的第一阶段，有必要在相邻骨组织和植入物表面之间建立牢固的连接。此外，将矫形植入物放置在人体的骨部位，例如骨折固定或关节置换，通常伴随着细菌污染的风险，因为有利于骨相关细胞代谢的生理环境也有利于微生物的粘附，就会导致植入物失败。

为了避免细菌附着和植入物的表面定居，并促进宿主组织的整合，添加含有抗菌物质的生物活性材料正受到越来越多的关注天然和合成聚合材料都被广泛用作药物输送平台，通过提供抗菌剂的调节负载和各种释放特性，如靶向离子释放、pH值变化或热反应能力。然而，在附近的骨组织和植入物表面之间获得牢固的结合是至关重要的，这可以通过用生物活性材料如生物活性玻璃或羟基磷灰石涂覆金属表面来实现。

为了配制用于骨植入物的抗菌和促再生表面，生物活性离子和聚合物在一个涂层系统中的组合正在被越来越多地研究。为此，铜(铜)是一个非常有趣的候选物，因为它已被证明对血管生成有影响，并且是一种强抗菌剂。研究表明，当人内皮细胞被诱导进行血管生成时，铜在内皮细胞中有显著的分布。另一项研究发现，铜与FGF-2生长因子结合，刺激体外血管生成。还证明了铜促进人内皮细胞的生长，并导致间充质干细胞向骨髓谱系的分化增强。在医疗保健环境中使用铜作为抗菌材料一直是人们非常感兴趣的话题，因为最近的许多研究都涉及到铜的“接触杀灭”效应的技术方面。据观察，长时间孵育后与铜表面接触的活生物体不会恢复，因为接触铜的影响以大约每小时7或8个对数的速度发生。

金属合金除了在机械强度和硬度方面的优点外，还有一些缺点。这些缺点主要与缺乏生物活性导致的表面腐蚀和纤维组织包裹时潜在的离子释放到人体内有关，这降低了植入物的长期稳定性[1]。不锈钢316 L可被认为是一种适合生物医学应用的材料，显示出适当的生物相容性和与其他参考金属相比在机械性能和较低成本方面的一些优势。然而，尽管有这些积极的方面，不锈钢在与周围组织的生物整合方面显示出一些缺点，这些缺点可以通过应用提供前整合特性的适当涂层来克服。

蛋白玉米醇溶蛋白是一种独特而复杂的天然生物聚合物；它属于醇溶性蛋白质，是玉米蛋白质的主要储存来源。玉米醇溶蛋白具有生物可降解性和生物粘附性，并具有特殊的氨基酸，如亮氨酸，可调节肌肉蛋白质代谢和脯氨酸，对破骨细胞的功能和活性具有积极作用，使玉米醇溶蛋白在生物医学领域具有很大的应用潜力。

基于这些前提，在这项工作中，结合生物活性玻璃和铜掺杂BG的玉米醇溶蛋白复合涂层采用电泳沉积法进行了开发，并根据我们之前对此类涂层的研究进行了进一步表征。在PBS中进行的降解研究、使用不同细胞的细胞生存力研究、抗菌活性、抗感染保护功效和小鼠模型中的体内研究首次调查了复合涂层在相关环境中的性能，从而对涂层的促再生和抗菌性能进行了评估。

当使用10 V的电压和5分钟的沉积时间时获得的电泳涂层显示在图1中。可以观察到，用10 V和5分钟沉积时间产生的涂层是多孔的、相当均匀的并且没有裂纹，即使表现出不同的表面形态。可以确定，玉米蛋白和玉米蛋白/CuBG涂层存在相互连接的孔，并且在整个涂层结构上分布。孔隙率似乎是由水水解形成的，并且考虑到玉米醇溶蛋白分子可以捕获在沉积过程中从电极底部移动到表面的气泡。当涂层内部的水蒸发(以及甘油)并形成多孔结构时，这种效应会导致孔的形成。在扫描电镜图像中未检测到立方氮化硼颗粒的存在。这表明颗粒通过涂层的厚度嵌入生物聚合物基质中。这种多孔结构的另一个原因可能是由CuBG颗粒之间的空间引起的。在玉米蛋白/血糖涂层的情况下，可以观察到表面的“第一层”显示一些玉米醇溶蛋白微球和孔隙，似乎是由水水解形成的。树枝状结构似乎由不同形状的玉米醇溶蛋白连接和形成，即细长的管和微球。通过直接目视检查未检测到BG颗粒。这种结构的形成可以分为两个不同的步骤。首先，围绕电极的玉米醇溶蛋白分子被沉积并形成第一层。这个过程之后是BG颗粒与玉米蛋白分子的结合，这可以导致不同的形状。那么就有可能是BG颗粒嵌入了这个被玉米蛋白覆盖的蠕虫状结构中。

图1。在10 V和5分钟沉积时间下，由EPD获得的玉米醇溶蛋白(a，d)、玉米醇溶蛋白/BG (b，e)和玉米醇溶蛋白/CuBG (c，f)涂层的涂覆电极的光学显微镜图像(上图)和SEM显微照片(下图)。

图2中报告了分别通过污染与金黄色葡萄球菌(图2a)、大肠杆菌(图2b)和表皮葡萄球菌(图2c)直接接触的涂层的抗菌活性的结果。玉米醇溶蛋白被认为是对照，假设在生物膜-浮游分离阶段后，由于缺乏抗菌性能，附着在这种表面上的细菌数量最高。正如预期的那样，玉米蛋白和玉米蛋白/BG涂层在每个测试时间点都没有显示出细菌代谢的减少。另一方面，与玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG涂层相比，铜(玉米醇溶蛋白/ CuBG)的引入导致粘附细菌细胞的生存能力急剧下降。用金黄色葡萄球菌获得的结果(图2a)证实了铜的功效。即使在24小时时效果不明显，但在随后的几天中观察到生物膜活性下降。对于表皮葡萄球菌生物膜，效果不太明显(图2c)。这里，与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌获得的结果不同，24小时后仅观察到生物膜活性的少量降低。此外，在随后的几天中没有观察到明显的生物膜降低，因此表明即使在连续处理中也存在一定的菌株抗性。然而，FESEM图像显示生物膜聚集体形成的差异，因为在铜掺杂的表面，与玉米蛋白/BG涂层相比，密集簇的存在似乎减少了。具体而言，大肠杆菌(图2b)显示了玉米蛋白和玉米蛋白/BG的类似结果；虽然当引入铜时，在24小时后检测到生物膜活性的显著降低。此外，在48和78小时后，生物膜的厚度降低，因此表明铜离子的释放随着时间的推移继续抑制生物膜的形成。最后，72小时生物膜的代表性扫描电镜图像证实玉米蛋白/CuBG表面缺乏生物膜生物量(图2d)。

图2。抗菌活性结果。将铜引入生物活性玻璃(玉米醇溶蛋白/CuBG)与玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG相比，细菌生存力显著降低(a-b-c，p < 0.05，用*表示)。扫描电镜图像显示玉米蛋白/CuBG涂层上缺乏明显的生物膜聚集体。比例尺= 10 μm。

在证实涂层支持细胞增殖和抑制细菌感染的能力后，研究了诱导成骨的可能性。在涂层配方假说中，生物活性玻璃的使用是为了达到这个目的，因为众所周知，由于其化学组成和固有的生物活性，BGs是最有利于骨样基质形成的无机材料之一。事实上，一般来说，当血糖被引入生理环境时，钠离子和钙离子被释放出来，在表面形成水合硅胶。然后，羟基碳酸磷灰石(HCA)通过不断掺入Ca2+、PO4 3、、和CO3 2而在表面结晶。在这项研究中，从生物学的角度研究了hFOB细胞在表面培养后的成骨作用。结果如图3所示。不出所料，与纯玉米醇溶蛋白涂层相比，玉米醇溶蛋白(玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白涂层)的存在加速了细胞分化；玉米醇溶蛋白/大豆球蛋白和玉米醇溶蛋白/大豆球蛋白涂层在7天和10天后在培养基中的碱性磷酸酶释放为与纯玉米醇溶蛋白涂层相比显著更高(p < 0.05，用*表示)，因此证实了BG促成骨刺激。然而，玉米醇溶蛋白单独支持成骨也是成功的，因为15天后所有值都是可比较的，表明细胞成熟相似。作为证实，15天细胞培养后的基因表达代表显示接种到所有测试涂层上的细胞表达相似水平的成骨基因ⅰ胶原(COL 1，图3b)、骨桥蛋白(OPN，图3c)和碱性磷酸酶(ALP，图3d)。成骨基因表达缺乏显著差异表明，所用浓度范围内的铜不会干扰干细胞分化。这是一个重要的发现，因为以前的工作表明，释放的金属离子可能是细胞分化的负面因素。

图3。成骨结果。与玉米蛋白涂层(a，p < 0.05，用*表示)相比，生物活性玻璃(玉米蛋白/BG和玉米蛋白/CuBG)的存在提高了第7天和第10天碱性磷酸酶的释放。21天后，成骨基因ⅰ型胶原(COL 1，b)、骨桥蛋白(OPN，c)和碱性磷酸酶(ALP，d)在所有测试的涂层中表达相似，表明细胞成熟相似。

玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG或玉米醇溶蛋白/CuBG涂层通过三元乙丙橡胶方法成功应用于不锈钢基底，证实了这种处理在金属表面引入生物活性元素的适用性。该涂层耐机械损伤，并且在长时间浸泡在生理条件下后，在视觉上表现为降解不良。BG和抗菌铜的存在赋予了块体材料骨传导和抗感染性能，从而克服了金属的生物活性差的问题。特别是，在生物活性玻璃中加入铜与玉米醇溶蛋白，成功地显著降低了涂层受关节病原体的感染，而不影响标本的细胞相容性。此外，铜引入了促血管生成特性，并且它不影响BG体外促成骨活性。所有这些发现使玉米蛋白/CuBG涂层成为一个非常有前途的系统，以改善生物惰性可植入金属材料的抗菌和促骨整合性能。

02、通讯作者简介

Laura Ramos Rivera

Institute of Biomaterials, Department of Materials Science and Engineering, University of Erlangen–Nuremberg .

Lia Rimondini

Department of Health Sciences, Universit` a del Piemonte UPO.

Aldo R. Boccaccini

Institute of Biomaterials, Department of Materials Science and Engineering, University of Erlangen–Nuremberg.

03、资助信息

本研究得到德国学术交流服务(DAAD)(德国)的奖学金和哥伦比亚大学(哥伦比亚)的资助。

04、原文信息

L.R. Rivera, A. Cochis, S. Biser, E. Canciani, S. Ferraris, L. Rimondini, A.R. Boccaccini, 

Antibacterial, pro-angiogenic and pro-osteointegrative zein-bioactive glass/copper based coatings for implantable stainless steel aimed at bone healing, 

Bioactive materials 6(5) (2021) 1479-1490.

Doi: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.11.001