通常，建立响应因子的过程需要使用单个杂质的对照品。为了准确测定，必须知道杂质的纯度，然后根据峰面积及浓度比计算响应因子。

确定UV响应因子可能的替代方法是使用两个检测器：标准的UV检测器和另一个检测器，其响应与重量或浓度成正比。则该信息与UV峰面积相结合将提供所需的RRF信息，而无需纯化杂质样品。如果有替代检测器，人们可能会合理地质疑是否需要紫外检测器和RRF值，因为它将直接提供有关杂质/母体相对含量的信息。但是，紫外线检测器价格便宜，坚固耐用且易于获得。因此，一旦确定了RRF值，便可以广泛应用于没有其他检测器可用的情况。

（一）1H-NMR与HPLC-UV联用确定RRF。

       该方法需要足够的杂质（通常大于10µg）才能获得定量的1H-NMR谱图。在NMR分析之前需要进行色谱分离，确定杂质的纯度足够高，以至于在母体药物存在下无需分离即可获得NMR光谱。将杂质的NMR光谱与母体药物在相同溶剂中的光谱进行比较（两种化合物都可在其中完全溶解）。然后选择至少一种特定于每种化合物的NMR共振峰，以使这些峰被完全分辨并易于积分。理想情况下，从已知结构中确定每个峰对应的氢。但是，仅了解与每个峰相关的分子量和质子数就足够了。获得杂质和母体药物的近似等摩尔混合物（在理想情况下）的NMR谱，并确定所选峰的面积。每个区域通过除以质子数来归一化。这些归一化峰面积的比率（杂质/母体）等于杂质与母体的摩尔比。除去NMR管中的溶剂，并在HPLC流动相中溶解。然后使用有关物质的方法将该稀释后的样品溶液注入HPLC-UV中。需要注意的是获得的峰面积在紫外检测器的线性区域内。对色谱峰进行积分，并获得给定波长下的峰面积比。最后，使用HPLC-UV和NMR峰面积比，质子数和两种物质的分子量计算RRF。

       其中i =杂质，p =母体化合物；＃H是与给定NMR峰相关的氢数，MW是分子量。

（二）蒸发光散射检测（ELSD）与HPLC-UV联用确定RRF。

       蒸发光散射检测（ELSD）已被证明广泛适用于非发色化合物的检测。尽管它仅限于挥发性流动相，但它价格便宜，相对坚固，易于使用，并且可以结合到许多HPLC方法中。对于具有相似结构和蒸气压的化合物，ELSD可以预期单位质量的响应相似。在这种情况下，可以将ELSD与紫外检测器结合使用，以峰面积比确定RRF值：

       其中i =杂质，p =母体化合物；

       上述公式的假设是ELSD峰面积与质量成正比。然而，ELSD响应取决于干燥时产生的颗粒的数量和性质。对于结构，电荷或蒸气压变化很大的化合物，或对于流动相组成变化的化合物（例如梯度HPLC），ELSD响应可能会显着变化。最后，ELSD信号与分析物的质量不是线性的，因此校准可能比使用UV吸光度检测器更复杂。

（三）CAD与HPLC-UV联用确定RRF。

       一种相对较新的检测方法—带电气溶胶检测（CAD），将洗脱的分析物转化为细颗粒方面类似于ELSD。但是，CAD不会使用光散射，而是通过电晕放电将电荷施加到粒子上，并通过静电计测量带电粒子的数量。对于大多数非挥发性分析物，CAD比ELSD更为灵敏，并且具有更宽的动态范围。对于分析物的质量，CAD响应不是线性，而是二次方。同样，响应主要取决于颗粒大小，而不取决于分析物的结构，只要它是不挥发的即可。与ELSD相比，CAD信号对颗粒性质的依赖性较小，因此对于各种非挥发性成分，其响应因子更加均匀。CAD与ELSD一样坚固且易于使用，并且在确定药物降解产物的相对UV响应因子方面显示出了巨大的潜力。但是，分析物在所使用的条件下必须几乎没有蒸气压，以便给出一致的单位质量响应。同样，流动相组成的变化会促进气雾液滴形成的变化，从而引起CAD响应的变化，就像ELSD一样。通常，给定分析物的CAD信号随着流动相中有机相（相对于水溶液）比例的增加而增加。因此，相对于较早洗脱的梯度，梯度反相HPLC-CAD往往会加重较晚洗脱的峰。因此，不能假定整个梯度的峰面积与相对质量或摩尔量直接相关。但是，可以通过将洗脱液1:1与来自第二相反梯度的洗脱液混合，然后再到达CAD来消除此错误。以这种方式，有机/水比在整个运行中在CAD处保持恒定。

（四）CLND与HPLC-UV联用确定RRF。

       用于RRF测定含氮化合物的有用检测器是化学发光氮特异性HPLC检测器（CLND）。该检测器基于HPLC流出物在富氧炉中的燃烧，将所有有机物转化为碳，氮，硫等的氧化物和水。然后，由含氮化合物产生的一氧化氮与臭氧反应，生成激发态的二氧化氮，该二氧化氮在返回基态时会发出光子。该化学发光响应与一氧化氮的摩尔数成正比，并且相应地与最初存在于分析物中的氮的摩尔数相对应。对于几乎任何含氮化合物（N 2和含N = N键的化合物除外），信号均与结构无关。因此，胺，酰胺，硝酸盐，含氮杂环等均产生与存在的氮的摩尔数直接相关的信号。只要已知分析物的分子式，就可以从HPLC峰中的氮含量确定其在样品中的相对重量。

      因此，定量只需要一个含氮标准，不必与分析物在结构上相关。此外，对于确定相对量，不需要任何标准。一旦找到相对量，就可以使用UV峰面积（例如，与CLND串联的UV检测器）来确定RRF，这很简单。因此，可以通过以下公式确定杂质相对于母体化合物的紫外线响应因子（每单位重量）：

      其中i是杂质，p是母体化合物，MW是分子量。＃N是分子式中的氮原子数。请注意，对于未知杂质，可以使用高分辨率LC-MS来确定分子对于摩尔（而不是重量）RRF值，每个分子仅需要相对氮原子数，而无需分子量。

       由于CLND具有等摩尔性质，因此无需馏分收集或纯化，无需标准液甚至无需知道分析物的浓度即可获得RRF信息。这大大简化了样品制备过程，并且杂质的稳定性也不成问题。

       当然，CLND仅限于不含氮的流动相。因此排除了常用于HPLC的乙腈和胺改性剂。此外，CLND在流动相中不适用非挥发性缓冲盐。但是，仍然可以确定在这些非CLND兼容HPLC条件下运行的样品的RRF值。在这种情况下，将使用两步过程。首先，使用CLND兼容的流动相（例如甲醇/水/三氟乙酸）分离目标化合物，并在这些条件下确定RRF值（RRF 1）。另外，通过使用两组HPLC条件（CLND除外）分析一个共同的样品，比较了使用CLND兼容和不兼容HPLC条件获得的UV峰面积。当然，必须跟踪目标峰以避免错误（例如，通过UV光谱比较）。然后，通过乘以在每种条件下获得的相对UV面积的比率，可以使用通过CLND兼容方法获得的相对响应因子（RRF1）来确定不同条件集的相对响应因子（RRF2）。

       其中i是杂质，p是母体化合物，1和2分别表示CLND兼容和不兼容的HPLC条件。

       或者，可以使用CLND分析样品以确定存在的分析物的相对量。然后，可以使用非CLND兼容的HPLC条件通过UV检测分析相同的样品，并使用等式计算RRF。该方法要求使用同一样品定义非CLND兼容的HPLC条件并在CLND分析时运行。相比之下，用等式描述的方法允许随时从CLND移开的位置运行单独的样品，尽管样品必须在两组HPLC条件下都进行UV检测。