反相键合相色谱法（C18，C8固定相）是目前最常用的一种色谱方法，当采用它进行药品杂质检查，特别是响应因子较低的杂质的检查时，为了提高方法对杂质的检测能力，通常采用较大的进样量，这时往往会出现色谱柱对主成分的过载。

按色谱动力学的解释，过载是由等温非线性分配引起。色谱理论认为，组分在固定相和流动相中按比例分配，当固定相和流动相一定时，分配系数只是温度的函数。当组分的量在一定范围内时，分配系数不变，组分在分配固定相中的量（MS）和流动相中的量（Mm）服从线性关系；当组分的量超过该范围，分配将偏离线性（等温非线性分配），色谱柱过载。过载有以下两种情况：

第一种情况如图1所示，色谱柱过载后，随着组分量的增加，k’变小。表现在谱带上就是浓度越大的区域迁移越快，表现在色谱图上就是出现一个呈近似直角三角形的拖尾的色谱峰（过载拖尾）。

第二种情况如图2所示，色谱柱过载后，随着组分量的增加，k’变大。表现在谱带上就是浓度越大的区域迁移越慢，表现在色谱图上就是出现一个呈近似直角三角形的前延的色谱峰。

一般在HPLC中第一种情况很常见，以下主要讨论过载拖尾的情况。

1.过载拖尾峰的峰型特征和危害

一般呈近似直角三角形，进样量越大，拖尾越严重，保留时间越短。虽然不同进样量下保留不一致，但色谱峰却都在同一时间结束。

由于峰结束的位置不变，所以这种拖尾峰对其后面的杂质分离不会有影响，但却容易覆盖前面的杂质峰，对它们的分离不利。

2.影响过载的因素及解决办法

（1）柱容量

柱容量越大越不容易过载。决定柱容量的指标是柱截面上固定相的面积占比，它与空容、填料的比表面积、表面健合率等色谱参数有关。

需要注意的是，增加柱长并不能增加柱容量，因为样品进样后不可能立即分布于整个色谱柱，同样因为无限直径效应的缘故，增大柱内径也不能增大柱容量。

（2）进样量

显然，减小进样量可以缓解过载，有时还能够达到分离杂质的效果。

如图4所示，进样量减小一半，主成分前相邻杂质峰从主成分峰中分离出来，但方法对杂质的检出能力也随着降低。

（3）组分分配到固定相中的量

柱容量一定时，分配到固定相中的量越少，保留越小，柱越不容易过载。理论上，在固定相中不分配时，组分不保留，再大的进样量也不会出现过载。对于C18/C8健合固定相，可以通过增加有机相比例减小组分在固定相中的分配来缓解过载，当然，随着有机相的改变，方法选择性也会发生变化。

图5中，有机相比例增加，保留减小，过载缓解，拖尾因子减小。

（4）组分的存在方式

对于易解离组分如酸碱性物质，在流动相缓冲容量足够的情况下，谱带上任一点解离型（离子）和非解离型（分子）的比例始终一致，离子型和分子型相伴以恒定的比例流出色谱柱，出现的色谱峰是离子型和分子型的叠加。

如果其中一个组分过载，表现出一个拖尾的色谱峰，另一组分虽未过载，但由于上述原因，也会表现为和过载组分形状一致大小不同的过载峰。因此易解离组分的峰型由过载的那一种存在方式决定。

一般离子型比分子型组分更容易过载，故易解离组分的过载由离子型的过载决定，过载程度与其占比有关。一般通过调整流动相pH抑制组分解离可大大减小离子型比例，缓解甚至消除过载。

对于强酸/碱性物质，难以通过调节pH抑制解组分的解离，这个时候可以通过形成离子对复合物来减小离子型占比以缓解过载。同样地，过载由离子型决定，形成的离子对复合物越多，离子型就越少，过载就越能得到缓解。

更复杂的情况是既抑制解离又存在离子对试剂的时候，这个时候可以通过上述两方面来改变离子型的占比，既可以缓解过载拖尾，又可以调整保留。情况虽然复杂，但手段却更加灵活多样。

（5）盐的浓度

对于离子型组分在C18/C8固定相上易于过载的原因，主要是因为离子型组分一旦进入固定相以后，离子间的排斥作用会阻止组分的进一步进入。

我们通常使用缓冲盐主要是为了维持流动相有足够的缓冲容量，但另一方面缓冲盐甚至是中性盐的加入还可以增加流动相离子强度，部分屏蔽组分离子间的相互排斥作用，减轻过载。同时盐还可以与离子组分形成离子对复合物，降低组分离子型比例来缓解过载。盐浓度越大，效果越明显。

以下以某一碱性化合物为例，通过实验探讨盐对过载行为的影响。该化合物含一个疏水性较强的芳香基团和一个伯氨基，碱性较强，pKa为9.9，在试验所用流动相pH下几乎全部以解离型存在。以下所有试验流动相缓冲液pH均用磷酸调节到2.5；流动相中有机相均为乙腈，除图中标出乙腈比例外，均为缓冲盐：乙腈=80：20；柱温30℃；测试波长210nm；色谱柱为AgilentSB-C18（4.6*150mm，5um）；供试品浓度为1mg/ml；进样体积为10uL。

图7表明，随着缓冲盐浓度的增加，过载得以缓解，峰拖尾因子逐渐减小。即使加入中性盐硫酸钠，也能起到相似作用。

图8中50mmol/L的硫酸钠起到比100mmol/L磷酸二氢钾更好的缓解过载拖尾的效果，因此50mmol/L的硫酸钠离子强度更大的缘故。

图7中三个色谱峰没有在同一时间结束，说明随着缓冲盐浓度的增加，容量因子发生变化。图中可以看出，盐浓度越大，容量因子越大，说明组分与缓冲盐中磷酸二氢根阴离子形成了保留更强的离子对复合物。唯一令人费解的是，图7中使用50mmol/L的硫酸钠时容量因子没有如愿增加。

缓冲盐与离子型组分形成离子对复合物所占比例到底有多少一直是笔者想知道的一个问题。其比例可以通过下式进行计算：

k’=x离子型﹒k’离子型+x离子对型﹒k’离子对型

x为各存在方式的占比，k’为相应的容量因子。

离子对复合物的保留应与分子型的保留相当，考虑到组分碱性较强，要测定组分分子型的保留值，需要完全抑制组分解离，流动相pH需要高达12以上，这在普通的C18柱上难以实现，故以伯氨基被酰胺取代的化合物代替该物质的分子型，并以此测得的保留值作为离子对复合物的保留值来及计算k’离子对型。

k’离子型用缓冲液盐浓度最低时（5mmol/L）的k’代替。

各缓冲液浓度下组分色谱峰均存在不同程度过载拖尾，故保留时间以色谱峰结束时的时间估算，应不至于产生太大误差（其实应于各条件下取低浓度组分进样，色谱峰不至于过载，能获得组分的准确保留值）。

由此可见，即使缓冲盐浓度高达100mmol/L，缓冲盐中磷酸二氢根阴离子与组分阳离子形成离子对复合物的比例仍不及1%。

一般离子极化能力越强，水合离子半径越大，形成离子对复合物能力也越强。PF6—与

ClO4—以其强大的极化能力和较大的水合离子半径使其在所有阴离子对试剂中在形成离子对能力方面名列前茅。一般PF6—＞ClO4—＞＞其他阴离子。

图9中采用六氟磷酸钾比采用相同浓度的高氯酸钠有更强的保留，显示PF6—比ClO4—更强的形成离子对复合物的能力,相应地前者比后者更大程度的缓解了过载，拖尾因子也较低。

图10中55.8min的为酰胺取代物的保留值，用它代替离子对复合物的保留值，计算出50mmol/L高氯酸钠和50mmol/L六氟磷酸钾与组分形成离子对复合物的比例分别为9.2%和22.7%。

既然过载由离子型引起，那就可以增加流动相中乙腈比例，减小离子型在固定相中的分配来减轻甚至消除过载。图11是将流动相中乙腈比例增加到40%，此时几乎全部以离子型存在的组分在固定相中几乎不分配，色谱图也没有显示出过载特征（T=1.11）。

然而不（低）分配也意味着不（低）保留，为了使主份有一定保留，可通过添加离子对试剂实现。图11添加50mmol/L高氯酸钠即使组分实现保留，同时色谱峰拖尾因子仍与几乎不保留时一致，进一步证明过载由离子型引起，缓解了离子型的过载就缓解了整个色谱峰的过载。

高乙腈比例使离子型组分在固定相中不分配以消除过载拖尾，添加离子对高氯酸钠来实现组分的合适保留是以上我们用到的方法。为了到达更强的保留，我们还可以使用带有不同碳链的烷基磺酸盐/硫酸盐类疏水性离子对试剂。如使用庚烷磺酸钠等。这类离子对试剂由于其形成离子对复合物能力很弱，加之使用浓度一般都很低（零点几到数个mmol/L），故形成的离子对复合物浓度很低，难以有效降低离子型组份的占比，对缓解过载几无贡献。但因为长的碳链的缘故，其形成的为数不多的离子对复合物的k’甚至远大于分子型组分的k’，故可以很好的延长组分的保留。

对于这类离子对试剂的保留机理，相比于高氯酸钠和六氟磷酸钾，由于其强的疏水性，除了上述形成离子对复合物的外，还存在一种所谓“动态离子交换”保留模式，即离子对试剂分布在C18上形成带有阳离子交换功能基的另一种动态的固定相，对阳离子组分有类似离子交换的保留作用。该离子交换的有效柱容量与流动相中有机相比例有关，因流动相中有机相与离子对在固定相上的分布存在竞争关系，流动相中有机相中有机相比例越大，分布在C18上的离子对越少，离子交换的有效柱容量越低。

组分在这种离子对试剂模式下的过载除了离子型在C18过载外，还包括离子型在所谓“离子交换固定相”上的过载。缓解或消除这两种过载的简单有效的方式是流动相中采用高有机相比例减少离子型组分在C18固定相上的分配，同时流动相中采用高盐浓度减少离子型组分在“离子交换固定相”上的分配。

图12两个色谱峰流动相均采用 40%乙腈，此时离子型组分在C18固定相上的过载基本被消除，流动相盐的浓度为5mmol/L时过载拖尾明显，盖因离子型在“离子交换固定相”上的过载所致，流动相盐浓度增加至50mmol/L时拖尾明显缓解。

更长碳链的离子对试剂的使用一直是个麻烦！如十二烷基硫酸钠，因为很容易导致峰型畸形。

图13水相中均还含有5mmo/L十二烷基硫酸钠，缓冲盐浓度高达100mmol/L峰型才达到正常，分析原因，可能是长碳链的离子对在C18上分布时容易引起取向混乱，导致形成“离子交换固定相”的硫酸钠基团在C18上分布不均引起。增加流动相中盐浓度能减弱甚至消除离子交换作用，使这种不均一的“离子交换固定相”的保留作用减小直至消除。

（6）梯度洗脱

在梯度洗脱过程中，一方面随着流动相有机相比例逐渐增加，组分在固定相中的分配也逐渐降低，过载的累积也就逐渐减轻。另一方面，对于低有机相比例洗脱时组分已经形成过载峰这一既定事实，梯度洗脱特有的所谓“谱带压缩机制”也可以进行部分“逆转”。我们知道，对于过载的谱带，组分浓度沿着柱入口到柱出口方向逐渐增加，而高有机相比例的流动相总是首先到达靠近柱入口的低浓度组分谱带区域，使它们不停追赶靠近柱出口的高浓度组分，最终使谱带压缩，以前过载拖尾的峰型得到缓解。