问：当我运行方法并测量色谱柱塔板数时，我的色谱柱塔板数约8000。但是生产商的文献中色谱柱塔板数为13000。您能解释这个差异吗？

答：色谱柱的塔板数不是固定的。对于给定的色谱柱，塔板数取决于流速，溶剂的粘度和分析物的分子量。仪器也可能会影响，但我们暂时将其忽略。

色谱柱生产商已经建立了标准化的条件，可以通过这些条件来检查色谱柱的质量。在反相色谱中，通常使用简单的疏水性分析物（例如甲苯，萘或苊）进行测量。检查这些化合物使用的流动相含有大量的有机溶剂。因此它们具有低粘度。另一方面，大多数HPLC用户正在处理更多极性化合物，这需要具有更高水含量的流动相。这些流动相具有较高的粘度。由于在正常HPLC条件下，随着粘度的增加，塔板数会减少，因此在实际使用条件下，塔板数要比在柱测试条件下要低。

问：如果在正常使用条件下的塔板数低于生产商报告的塔板数，生产商是否会在色谱柱性能方面误导用户？

答：不是。这不是它的目的。生产商使用的色谱柱测试程序旨在检查色谱柱的质量，并且最好在色谱柱的塔板数达到或接近最大值的情况下完成此操作。这是柱填充技术影响最大的地方。因此，如果我要检查包装技术的质量，这就是我要对其进行测量的地方。

问：请多解释一些原因，为什么塔板数会随着流速，塔填料等的变化而变化！

答：塔板数对各种参数依赖性的根本原因是减小的板高，以及它对减小的流速的依赖性。我将对此略作概述，但是为了更深入地了解，我们需要看一本有关色谱的教科书。

色谱柱的塔板数是色谱柱长度L除以降低的板高h和粒径dp：

柱长和粒径是固定的（已知）。减小的板高度取决于减小的速度，其定义如下：

这个方程包含线速度u，样品在流动相中的扩散系数DM以及粒径。大部分HPLC工作都是在降低的流度（在3到20之间）下进行的。

文献中有几个方程式描述了减小的塔板高度对减小的速度的依赖性。在此处讨论的速度范围内，它们给出相同的结果。因此，让我使用最简单的一个，它基于van-Deemter方程：

该系数是经验值，并且已从广泛的数据库中获得了反相操作条件的系数。通过这种关系描述的曲线具有最小值，它以约2.5的降低速度达到。第一系数是填充均匀性的量度。因此，这取决于包装过程。

Thecolumnplatecountdependsonthereducedvelocityas  follows:

色谱柱板塔数取决于降低的速度，如下所示：

因为HETP对速度的依赖性最小，所以塔板数对速度的依赖性最大。稍加演算就可以看出最大板数约为L / 2.3 dp。因此，我们可以得出结论，填充5µm颗粒的15 cm色谱柱的最大板数为13000，是一个很好的色谱柱。

不良的色谱柱填充对方程式3的第一个系数有很大的影响，而其他的则保持大致相同。当其他因素的影响最小时，此系数的影响最大。这就是为什么要在最大塔板数或接近最大板数的条件下测试色谱柱的原因。

现在让我们解决您的问题的第二部分，塔板数对流量的依赖性。我通过降低速度来弥补这一点。首先，降低的速度与线速度成正比，线速度与流速成正比。因此，塔板数取决于流速。在非常低的流量下它是低的，而在高流量下它也是低的。最大塔板数介于两者之间。但在哪里？从方程2中降低的速度的定义可以看出，降低的速度包括分析物在流动相中的扩散系数。从上面的结果我们知道，以2到3左右的速度降低出现最大塔板数。对于测试样品中的疏水性分析物的色谱柱的流动相通常为70/30（v / v）乙腈/水，对于5µm的色谱柱，这意味着线速度为1至1.5 mm / sec。对于内径为3.9mm的色谱柱，对应于该线速度的流速约为0.5至0.7ml/min。对于内径为4.6mm的色谱柱，对应于该线速度的流速约为0.7至1 ml/min。

由于曲线最小值的点取决于扩散系数，因此我们需要知道扩散系数与流动相的关系。文献中有一些方程式，这些方程式使我们能够估计分析物在特定溶剂中的扩散系数（例如，Wilke-Chang方程式）。然而，对于当前的讨论，我们只需要知道扩散系数与流动相的粘度成反比：

这意味着发生最大塔板数的速度（或流速）随粘度的增加而降低。70/30（ v / v）乙腈/水的流动相的粘度为0.7 cP，而50/50（ v / v）甲醇/水的流动相的粘度为1.8 cP。当我们使用甲醇/水流动相时，对于装有5 µm颗粒的3.9 mm色谱柱，最佳流速降低至0.2-0.3 ml/min，而对于4.6 mm色谱柱，则降低至0.3至0.45 ml/min。在方法开发过程中，这一点值得牢记。

有一个有趣的方面扩散系数对溶剂粘度有依赖性。改变流动相组成时，可以使用以下经验法则来估算色谱柱性能：在不同的流动相中，相同的色谱柱在相同的背压下将得到大约相同的塔板数。请记住一个有用的规则！