概述

卤代烷烃是药物合成反应中使用非常广泛的烷基化试剂，例如盐酸非索非那定和米拉美林合成工艺中使用碘甲烷作为烷基化试剂、4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮是奥美沙坦酯合成中用到的一个关键起始物料。2006年EMEA颁布的《遗传毒性杂质限度指导原则》和FDA发布的《原料药和制剂中的基因毒性和遗传毒性杂质：推荐方法》中都有提到，由于卤代烷烃的反应活性很活泼，通过亲电取代反应，能够与生物活性大分子（如DNAs、RNAs和蛋白质）直接发生烷基化反应，或卤代烷烃可以在光照或其他激发能量作用下产生自由基，这两种方式都对DNA进行直接或间接作用，可能会导致DNA突变，与这类试剂接触可能存在一些致癌风险，严重危害人类健康。

卤代烷烃在药物合成中大量使用，结构种类繁多，是基因毒性杂质中最为多见的一类。卤代烷烃，单卤代烯烃，氮芥，硫芥是典型的遗传毒性致癌性物的警示结构（如图1），其中氯甲烷、氯乙烷已被证实为是已知的基因毒性杂质。药品合成中产生的卤代烷烃中间体或杂质是否为基因毒性杂质是现阶段药物研究过程中重要讨论和控制的内容，也已成为国内外药品注册审评不可缺少的项目，因此根据不同卤代烷烃杂质的性质，需要在药品中建立相应的检测方法对其进行控制。

图1.卤代烷烃化合物结构图

根据参考各国药典及文献，总结了部分含有卤代烷烃类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

表1. 含有酰氯类基因毒杂质药物列表

常用检测方法

直接检测法：

对于具有挥发性的卤代烷烃，如卤代甲烷、卤代乙烷和卤代丙烷，因其具有很强的挥发性，所以气相色谱法是此类基因毒杂质的主要分析手段。因一般常用的氢火焰离子化检测器（FID）的灵敏度较低，故多采用电子捕获检测器（ECD）作为检测手段并结合顶空进样（HS）的方式来测定药物中挥发性卤代烃。有文献显示，相同浓度下的短链卤代烷烃中，碘代烷烃的灵敏度最高，氯代烷烃的灵敏度最低，同时含有多个氯原子或者溴原子的烷烃也具有很高的灵敏度。因此，ECD检测器更适用于测定含溴和含碘的烷烃化合物，尤其是含有多个卤原子的烷烃，而对于只含有一个氯原子的烷烃化合物，一般采用灵敏度更高的气质联用技术GC-MS进行测定。

对于非挥发性的卤代烷烃，HPLC-UV是药物分析中最常用的分离检测手段，该法适合于具有紫外吸收的卤代烷烃，由于基因毒检测是痕量检测，故HPLC的检测灵敏度就相对较低。而对于含N的卤代化合物，常采用液质联用技术（LC-MS）法进行测定，以达到提高检测灵敏度的目的。

衍生化法：

当样品不能直接进样分析时，为了满足分析方法的要求，同时也能够提高卤代烷烃的检测灵敏度，通常会选择柱前衍生的方法进行检测。据文献报道，用4-二甲氨基吡啶和1-（4-吡啶基）哌啶-4-甲酸正丁酯作为衍生化试剂，采用HILIC-MS/MS（亲水相互作用色谱）及CE-MS（毛细管电泳法）测定卤代烷烃，虽灵敏度可以达到，但都存在衍生化时间较长的问题。而采用二甲胺、三甲胺为衍生化试剂时，不仅能避免原料药和其他物质的干扰，且反应简单快速，还能够达到很高的检测灵敏度（LOD能够达到ng级）。除此之外，还有采用3-碘苯甲酰氯为衍生化试剂，采用LC-ICP-MS（电感耦合等离子体）来测定药物中基因毒杂质4-氯1-丁醇，其LOQ能够达到1.25ng/mL。

以下两个案例可供借鉴

双丙戊酸钠：

双丙戊酸钠（Divalproex sodium，化合物1，图2），是新一代丙戊酸类衍生物，是一种新型广谱低毒抗癫痫药物。在双丙戊酸钠的合成工艺（图2）中，一般以丙二酸二乙酯作为起始原料，在乙醇钠溶液中，滴加1-溴丙烷试剂进行缩合反应，得到中间体4，然后在酸性条件下水解，得到中间体5，之后在180℃减压蒸馏3 h，脱羧得到中间体6，最后滴加NaOH溶液搅拌反应制得双丙戊酸钠成品。双丙戊酸钠的合成工艺中使用到的1-溴丙烷试剂（化合物3，图2），其结构与已知基因毒性杂质结构类似，具有警示结构，因此必须对其严格控制，控制其毒理学阈值（TTC）。根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d计算，双丙戊酸钠最大日剂用量为3g/d，则对应的基因毒性杂质1-溴丙烷的TTC水平为0.5ppm。

图2. 双丙戊酸钠的合成工艺

因此，采用GC-MS，顶空进样的方法测定1-溴丙烷。根据ICH指南要求，对该方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，1-溴丙烷在0.1ppm~0.75 ppm的范围内均成良好的线性关系，相关系数R2=0.9999，1-溴丙烷的LOD和LOQ分别能够达到0.05 ppm及0.1 ppm，平均回收率为97.3%，该方法灵敏度非常高、无干扰且操作简单，适合在痕量水平下对双丙戊酸钠中基因毒杂质1-溴丙烷进行控制。

阿瑞吡坦:

阿瑞吡坦（Aprepitant，化合物7，图3）是美国Merck公司开发的一个具有全新作用机制的止吐药，也是由美国FDA于2003年批准上市的第一个神经激肽-1（NK-1）受体阻滞剂。阿瑞吡坦的合成是以(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)吗啉（化合物8，图3）为中间体，与另一个中间体2-(2-氯-1-亚乙基)酰肼甲酸甲酯（化合物9，图3）进行缩合反应得到中间体10，然后中间体10在高温下环合制备而得到阿瑞吡坦成品。事实上，所用到的中间体2-(2-氯-1-亚乙基)酰肼甲酸甲酯（MIC，化合物9，图3）已经被证实具有潜在的遗传毒性和致癌性，因此，依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对阿瑞匹坦中的2-(2-氯-1-亚乙基)酰肼甲酸甲酯的残留进行定量分析。

图3. 阿瑞吡坦合成工艺

因此，采用二甲胺为衍生化试剂，将MIC转化为叔胺类衍生物MDC（如图4），然后利用LC-MS的方法进行检测，以0.01M甲酸铵水溶液-甲醇为流动相，在该方法下MIC的LOD和LOQ分别为1.2ppm和4.0ppm，在4.0~15.0 ppm的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2=0.998，回收率为84.8-92.8%。该方法快速、简单、准确且经全面验证后符合检测的需求。

图4. MIC衍生化反应式

总结

卤代烷烃类化合物作为潜在的基因毒性杂质，通常作为烷基化试剂存在于药物合成过程中，这些微量的反应试剂会作为杂质存在于终产品中，可能具有遗传毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，药品中如果含有上述种类的基因毒性杂质，就需要对其进行严格的控制。由于卤代烷烃类基因毒种类繁多，且化学性质都非常活泼，因此给分析方法的开发带来了巨大的挑战。

基因毒性杂质对药品质量的影响是不可忽视的，药品研发人员、生产者应尽可能地明确药品中各类基因毒杂质的结构、来源、毒性、检测方法以及质控限度，通过对药品生产工艺的改进及优化来降低杂质的含量，从起始原料控制、中间过程控制、终产品控制以及流通、贮藏等各个环节保证和提高药品的质量。在基因毒杂质整个研究过程中，最重要的就是分析方法的开发与验证，需要从杂质的结构特征、理化性质、剂型特征、工艺过程等各个方面综合考虑、严谨研究、规范验证。因此，建立一个科学可行的分析方法是基因毒杂质研究与控制的基石。

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：

1.Raman N.V.V.S.S., Prasad A.V.S.S., Reddy KR. Sensitive derivatization methods for thedetermination of genotoxic impurities in drug substances using hyphenatedtechniques[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014 (89):276– 281.

2.Raju K. V. S. N., Reddy P. M, Sreenivas N, et al. Quantification ofpotential genotoxic impurity in Divalproex sodium drug substance by GC-MSmethod[J]. Der Pharmacia Lettre, 2016, 8 (8): 388-394.

3.Harigaya K, Yamada H, YakuK, et al. Novel sensitive determination method for agenotoxic alkylating agent, 4-chloro-1-butanol, in active pharmaceuticalingredients by LC-ICP-MS employing iodo derivatization[J]. Analytical Sciences,2014, 30(3): 377-382.