概述:

水合肼（结构见图1）是一种常用的医药中间体，可作为还原剂，参与多种不同类型的药物的合成。由于反应过程中副产物只产生氮气和水，所以水合肼是一种绿色还原剂，工业应用极其常见。

图1. 水合肼

由中国化学家黄鸣龙改进的基斯内尔-沃尔夫-黄鸣龙还原反应（Wolff-Kishner）反应（见图2）是水合肼作为还原剂的经典人名反应，在碱性条件下将醛类或酮类试剂与水合肼作用，醛或者酮羰基被还原为亚甲基，反应在常压下即可完成，反应时先将反应物与氢氧化钠、水合肼和高沸点醇类的水溶液混合加热，生成腙后，将水和过量肼蒸出，待温度达到195～200℃时回流3～4小时后完成，其中酮和醛羰基都通过中间体转化为亚甲基或甲基。

图2. 基斯内尔-沃尔夫-黄鸣龙还原反应（Wolff-Kishner）

另外，水合肼作为关键的氮源中间体也经常在药物合成中使用，常用作制药原料。如合成物料氨基尿，该物料用于生产呋喃西林、呋喃妥因、肾上腺色腙，氢化泼尼松、氢化可的松等药物，也用于测定醛、酮试剂；也可合成物料异烟肼，该物料可用于生产治疗结核病的一线药物、抗心律失常药，如呋喃西林盐酸阿齐利特；除此之外，水合肼可以直接用来合成半合成氨基糖甙类抗生素，如硫酸阿米卡星及生产用做耐药β-内酰酶的抑制剂，如他唑巴坦酸等，同时水合肼还常用于生产多种农药，如植物生长调节剂，落叶剂及除草剂等。

水合肼可对肝、肾、血液等系统产生毒副作用，ICH M7有数据显示，水合肼具有致突变性，通常作为遗传毒性杂质控制。因此，要求药品中水合肼的残留量必须低于可接受限度以下。由于水合肼类化合物较活泼，极性较大，通过常规HPLC色谱柱保留较差，如何快速、简便、高灵敏地监测生产过程中肼的残留量，一直是目前关注的重点问题。

常用的检测方法:

气相色谱质谱检测法：

目前利用气相色谱法检测水合肼一般采用直接和衍生化法。直接法是采用热导检测器分析，但其灵敏度低，且水合肼是强碱性化合物，对柱子要求也比较高。衍生化则一般采用2，4-二硝基苯甲醛或乙酰丙酮用作衍生化试剂。有文献报道采用丙酮作为衍生化试剂（见图3），室温条件反应15min，通过顶空-气相色谱质谱法对原料药中的水合肼含量进行了分析检测，定量限可低至0.1 ng·ml-1。在几种原料药的方法学验证中发现，Std浓度在1 ng·ml-1-20 ng·ml-1的水平上水合肼衍生产物的加标回收率在80%和117%之间。6针Std浓度为1 ng·ml-1时的精密度通常在2.7%至5.6%之间。在1 ng·ml-1-10 ng·ml-1水平的线性曲线Y = 1660.9X−169.42，R2 = 1.0000。

图3. 丙酮与水合肼的衍生反应

液相色谱检测法：

由于水合肼的弱保留性，通常很难通过高效液相色谱直接检测，所以水合肼的液相色谱法也是采用衍生化法。衍生试剂一般采用具有强共轭基团的醛酮。诺衡生命科技采用2-羟基-1-萘甲醛作为衍生试剂已成功开发对多个方法对各种原料药中的水合肼含量进行分析检测（见图4），定量限可低至5 ng·ml-1。Std浓度在10ng·ml-1-50 ng·ml-1的水平上水合肼衍生产物的加标回收率在80%和120%之间，在1 ng·ml-1-10 ng·ml-1水平的线性曲线Y = 872.14x − 153.4，R2 = 0.9996。

图4. 丙酮与水合肼的衍生反应

液相色谱质谱检测法： 

对于一些灵敏度要求更高，或者溶解性较差的API中水合肼类化合物的含量检测，诺衡生命科技还建立了液相色谱质谱联用的方法，这些使用各种酰氯作为衍生试剂，符合各种实验要求，由于篇幅限制，在此不再赘述。

案例:

依鲁替尼：

依鲁替尼（见图5）是一种小分子BTK抑制剂，能够与BTK活性中心的半胱氨酸残基共价结合，从而抑制其活性。2013年11月13日，美国食品药品管理局（FDA）批准了依鲁替尼可用于套细胞淋巴瘤(MCL)的治疗。

图5.依鲁替尼的合成路线

依鲁替尼常见的合成路线中（见图5），水合肼作为氮源参与5-氨基-1H-吡唑-4-腈环的合成。根据ICH M7要求计算，对于水合肼的检测是必要的。作者以水杨酰为衍生试剂，十八烷基为固定相，对伊鲁替尼中潜在的遗传毒性杂质水合肼含量进行测定，色谱柱尺寸采用4.6 mm * 250 mm，粒径为5 mm （Inertsil ODS-3V）。流动相采用0.02 M正磷酸二氢铵水溶液和乙腈（35:65）。使用等度洗脱模式进行分离，流速为1.0 mL /min，柱箱温度为40℃。检测的波长为354 nm。所开发的方法已按照ICH指南进行了验证，发现具有良好的线性，准确度和中间精密度，检测限可低至0.81ppm。溶液在48小时内稳定，该方法可成功用于依鲁替尼中水合肼的测定，用于常规分析和稳定性评估。

表1.低、中、高三个浓度加标回收率结果

表2.中间精密度结果

表3.线性结果

总结:

水合肼及肼类化合物常被用作还原剂或者氮源中间体存在于药物合成过程中，这些物质可能会残留于终产品中成为杂质，对人体器官如眼、上呼吸道产生强烈刺激作用，并损害肝、肾组织和心肌等，更因其致癌性和致畸变性导致癌症和遗传性基因损害的发生。因此，药品中如果含有水合肼及肼类化合物残留，药品就会存在质量缺陷并对人类健康造成威胁，建立快速、灵敏、准确、可靠的分析方法以控制药物中水合肼及肼类化合物的含量在人类医药领域发展进程中显得尤为重要。

基因毒性杂质最主要的特点是在极低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，导致基因突变并促使肿瘤发生。因其毒性很强，对药物的安全性造成强烈的威胁，行业中已多次出现由于基因毒性杂质控制不合规，造成上市药品强行被召回的案例，给企业造成了巨大的损失。因此，在个体对自身健康更为重视，审查机构对药品质量合规性核查更为严格的今天，如何更好的运用QbD理念以控制药品中基因毒性杂质的含量并最大程度的降低成本，已成为当今企业的必修课之一。

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：

1. Sun, M., Lin, B. , & Liu, D. Q. A generic approach for the determination of tracehydrazine in drug substances using in situ derivatization-headspace gc-ms. JPharm Biomed Anal. 2009, 49(2), 529-533.

2. Rrg, A., Am, A. , Jas, A. , & Sm, B. Determination of potential genotoxic impurityhydrazine hydrate in ibrutinib by rp-liquid chromatography - sciencedirect.2020.

3. 周延生，李赛钰，韩东升等.药物中水合肼残留量的气相色谱分析分析试验室，2008,27 (3): 84-85.

4. Gionfriddo, E. , Naccarato, A. , Sindona, G. ,& Tagarelli, A. Determination of hydrazine in drinking water: developmentand multivariate optimization of a rapid and simple solid phasemicroextraction-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometryprotocol. Analytica Chimica Acta. 2014, 835, 37-45.