近年来，已有多种药品（DPs）因检测出亚硝胺类杂质被从市场上召回。本文将概述药品中亚硝胺类杂质及其检测方法的研究进展，并着眼于建立更加高效的分析方法。

背景

2018年6月，浙江华海药业（ZHP）在其仿制原料药缬沙坦（一种血管紧张素II受体阻滞剂）中检出一种未知杂质。经过鉴定，该杂质为基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺（NDMA）。随后，调查扩大到沙坦类所有的原料药及制剂，多家药品制造商发起产品召回。

目前，关于药物中亚硝胺类杂质污染的确切来源已有多种推测。经过评估，华海药业认为缬沙坦原料药中检出NDMA可能与其生产过程中使用了亚硝酸钠去除过量的叠氮化钠有关。该过程可能导致生成亚硝酸，而亚硝酸与痕量的二甲胺会发生反应生成NDMA。此生产工艺（变更前使用叠氮化三丁基锡）于2012年获得美国FDA批准。

2019年9月，美国FDA发布公告称，在一些常用胃灼热治疗药物（例如：雷尼替丁和尼扎替丁）中检测到了不可接受水平的NDMA。随后，Amneal和Mylan等药品制造商发起了大规模的相关产品召回。2020年，欧洲药品管理局（EMA）下属的人用药品委员会（CHMP）也建议暂停所有欧盟境内的雷尼替丁药品。

2019年12月，药品监管机构又发布公告称在降糖药二甲双胍中也检测到了NDMA残留。2020年8月，Bayshore Pharmaceuticals等药品制造商对相关产品进行了召回。

杂质来源

为了查明药品中亚硝胺类杂质的来源，各药品监管机构及整个制药行业都作了大量的调查。美国FDA在最新版指南（2020）中列出了至少七个可能引入亚硝胺杂质的根本原因，EMA 最新指南也发布了 11 个可能来源。这种来源的多样性及不确定性，使得对药品中亚硝胺杂质进行准确的风险评估极具挑战性。

如果在酸性条件下同时存在仲胺和亚硝酸盐，两者可能反应生成亚硝胺类杂质。除物料本身带有仲胺结构外，叔胺和季铵类试剂也可能引入仲胺杂质；酰胺类试剂也被认为是另一种仲胺来源。此外，从供应商处采购的原料若受污染也可能会引入亚硝胺类杂质。因此，完全透明地了解原料供应链对于防止污染至关重要。

生产工艺中若使用了回收物料，如溶剂、试剂和催化剂等，都可能会因为有残留胺等杂质而具有引入亚硝胺类杂质的风险。美国FDA指南中还指出，同一生产商、同一工艺生产的原料药在不同批次中也可能有不同数量、不同种类的亚硝胺杂质，差异较大；此外，亚硝胺类杂质可能在药品存储的过程中引入，甚至在饮用水中也可能引入。

建议和分析

EMA和美国FDA发布的亚硝胺杂质“指南”文件为制药行业提供了类似的建议，即首先要对原料药及药物制剂进行风险评估，以识别亚硝胺类杂质生成或受交叉污染引入的可能（第一阶段）。EMA要求所有化学药必须在2021年3月31日之前完成评估，而生物类药的评估则要在2021年7月1日之前完成。第二阶段，要求对上述识别出亚硝胺风险的药品进行检测确认；如适用，可以通过变更生产工艺用于消除亚硝胺污染的可能。

同所有其他基因毒类杂质，药品监管机构也为亚硝胺类杂质制定了国际公认的每日可接受摄入量（ADI）限值。药品监管机构建议药品制造商应召回亚硝胺杂质残留量超出ADI限值的产品。

亚硝胺类杂质的致癌风险高，其ADI值较低。这就给分析检测技术，尤其是要适用于多种药物检测，提出了巨大的挑战。一般来讲，要检测ADI限值水平的亚硝胺杂质，需要使用高灵敏度的检测手段，其定量限（LOQ）应能达到十亿分之一（ppb）水平，方法定量限应满足小于等于0.3 ppm。若需同时检测多种亚硝胺杂质，其定量限还要更低。

在开发此类分析方法时，需要综合考虑多个技术要点：

i. 测试材料（例如水、气源、塑料产品和橡胶/弹性体产品）中存在痕量亚硝胺杂质造成干扰；

ii. 样品制备过程中引入污染（避免手套、滤膜、溶剂等造成的交叉污染），可能导致测试结果假阳性；

iii. 分析过程中亚硝胺的原位生成；

iv. 共流出分析物造成干扰（例如，已报道的二甲基甲酰胺（DMF）和NDMA）。

基于上述因素，样品中亚硝胺类杂质的检测应采用空白对照试验，同时可以考虑使用正交分析技术。为了最大程度的提高选择性，同时避免杂质峰误判及共洗脱，高分辨色谱技术（如UPLC）联用高分辨质谱（如HRMS,提供精确质量数）或串联质谱逐渐成为常用的分析手段。关于这些技术实际应如何选择，各监管机构近期也相继给出了参考建议。整体来看，UPLC-HRMS联用技术被认为是目前用于检测原料药及药品制剂中亚硝胺类杂质最为有效的分析技术，可以实现适当检测水平下多种亚硝胺类杂质的同时检测。

前景展望

目前已有多种亚硝胺杂质分析方法能够满足灵敏度及其他多种典型验证参数的接受标准，但都是局限于特定目标化合物的检测技术，测试前须对原料药及制剂中可能存在的特定亚硝胺杂质种类进行预判。

对于任何风险评估过程，其关键目的都是制定一份目标杂质清单。然而，它不仅受限于我们当前对亚硝胺类杂质生成机制的了解，也受限于我们缺乏对原材料供应链细节的把握。后者可能更为重要。因此，不可否认，现有的亚硝胺杂质测试策略是有缺陷的，因为它选择性地排除了对其他亚硝胺杂质的检测。

EMA在最新发布的亚硝胺类杂质指南中建议，采用正交法可能有助于缓解上述分析策略的缺陷。将正交法应用于起始的整体筛查策略，可以实现对样品中亚硝胺杂质总量的评估。理论上，亚硝胺杂质总量应等于LC-MSMS法（或其他等效方法）测得的各个单种特定亚硝胺杂质残留量的总和。若两者存在差异，则表明样品中还可能存在其他的亚硝胺杂质。

实施正交筛查策略，可靠的分析手段必不可少，须能够满足在适当LOQ水平下实现亚硝胺基团的特异性检测。同时，这种分析手段还要适用于各种不同的样品类型和基质，不仅能应用于检测成份相对简单的原料药，也要适用于配方复杂的药物制剂。

目前，这种筛查策略已成功应用于其他领域。常见方式有两种：1）对特异性分析技术进行调整。例如：利用LC-MSMS检测亚硝胺化合物共有的特征结构，以实现样品中亚硝胺杂质总量的检测；2）使用“真正”的正交分析手段。例如：热能分析技术已在食品分析领域获得广泛应用，后续也可尝试用于药物分析领域。

无论采用哪种方式，将正交筛查法应用于药品中亚硝胺类杂质的分析策略，其结果都更令人信服、也更加准确，可以确保具有潜在风险的生物/药物产品的最终安全。实际上，这种策略也可以减少当前采用特异性分析策略产生的费用和时间，为药企提供一种更为高效的途径。

SGS亚硝胺测试解决方案

SGS拥有全球性的实验室网络，可以为生物/药物制造商提供全面的检测服务，确保其产品不受亚硝胺杂质的污染。我们配备有最先进的分析手段，例如：LC-MSMS、LC-HRMS及GC-MSMS等，已成功实现多种基质中亚硝胺杂质的分析检测。

我们建立的方法符合GMP质量管理体系，并根据ICH Q2进行了充分验证，适用于各种药物制剂及原辅料的检测。

附表为目前上海实验室已完成的亚硝胺杂质种类汇总