锌及其合金因其适宜的降解速率成为生物可吸收心血管支架的候选材料。本工作研究了Zn-Mg和Zn-Cu合金的力学性能、生物降解性和生物相容性，以确定合适的合金成分以获得最佳的支架性能。Zn-1Mg在Hanks溶液中表现出较高的屈服强度(YS)和极限抗拉强度(UTS)以及较好的降解稳定性。Zn-Cu合金对金黄色葡萄球菌的抑菌效果受扩散机制和接触机制的控制。

01、研究内容简介

冠状动脉疾病(CAD)是最常见的心脏疾病，该疾病威胁人类健康、生活质量和寿命，其特征是由于血栓的形成而导致动脉堵塞。通过支架植入的经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已成为治疗动脉粥样硬化最流行的方法，全球每年植入约300万个支架。心血管支架植入的目的是为动脉提供支撑，以避免血管在重塑过程中产生回缩。虽然支架的使用代表了心血管疾病治疗的革命性进步，但支架内再狭窄(ISR)和晚期支架内血栓形成(LST)仍然是冠状动脉介入治疗的主要限制因素。裸金属支架(BMS)在动脉内的植入会破坏健康的内皮细胞，导致平滑肌细胞(SMCs)不受控制的增殖，致使15-30%的PCI患者出现ISR。自从药物洗脱支架(DES)进入临床应用以来，ISR的发生率已降至<5%。然而，由于内皮细胞(ECs)迁移和增殖的延迟以及普通金属暴露在血流中的时间延长，导致LST的风险增加。因此，新一代生物可吸收支架(BRS)应运而生，它可以帮助动脉愈合并且没有植入残留物，从而克服副作用。

2011年，Zn被认为是一种潜在的生物可吸收金属，并具有介于Fe和Mg之间的良好的生物相容性和适当的生物降解率。然而，Zn及其合金作为生物可吸收金属的开发和表征必须进行严格的研究，以确定和控制它们的生物相容性、降解速率和最佳力学性能。因此，需要透彻地了解不同合金相在纳米尺度上的力学性能，以及生物体液的氧化副产物和种类。与纯锌相比，Zn-Cu合金的延展性显著下降，而Zn-Cu合金的延伸率超过30%，这成功地满足了心血管支架应用的标准。此外，Cu因其抗菌特性而广为人知，据报道它能刺激内皮细胞的迁移和血管生成。目前还没有关于Zn-Mg和Zn-Cu合金不同相在纳米尺度范围内的力学行为的研究。

本工作旨在更好地研究包晶相和共晶相在Zn基体中的添加及其对Zn-Mg和Zn-Cu合金腐蚀性能和纳米级力学性能的影响。为此，利用动电位极化(PDP)和电化学阻抗谱(EIS)对Zn基合金在Hanks溶液中的纳米压痕进行了表征和腐蚀评价。通过分析释放出的Zn2+、Mg2+和Cu2+阳离子，评价了浸泡试验中合金的离子释放性能。最后，评价了Zn基合金与人主动脉内皮细胞(HAoECs)的体外生物学反应、琼脂扩散法检测的细菌活性以及金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的粘附性。

图1显示了横截面（左）和纵截面（右）中样品微观结构的SEM图像、检测到的相及其体积分数。纵向截面的微观结构证实了锌基合金冷轧制造过程中的晶粒择优取向（图1d、f、h、j）。纯Zn微观结构由不均匀的锌晶粒组成，横截面尺寸从200μm到1mm不等，并伴有部分再结晶。另一方面，Zn-Mg合金的显微组织由Zn基体和沿α-Zn晶界形成的Zn+Mg2Zn11共晶混合物组成（图1c-f）。Zn-Cu合金呈现出Zn和枝晶ε-CuZn5相的双相组织（图1g-j）。

图1. 挤压Zn (a, b)，冷轧 Zn-0.5Mg (c, d)，Zn-1Mg (e, f)，Zn-3Cu (g, h)，Zn-5Cu (i, j)的横截面 (左) 和纵截面 (右) 的显微结构。

拉伸力学性能和维氏硬度结果如图2所示，参数包括极限抗拉强度(UTS)、屈服强度(YS)、断裂伸长率(E%)和维氏硬度(HV)。纯Zn具有较低的YS(30±6MPa)、UTS(97±7MPa)和延伸率(8±2%)。添加Mg作为合金元素增强了纯Zn的力学性能。事实上，在所有材料中，Zn-1Mg 的屈服强度和极限抗拉强度最高。另一方面，与Zn和Zn-Mg合金相比，Zn-Cu 合金显示出更大的断裂率。拉伸试验后的断口形貌如图2b所示。纯锌的断口呈完全的穿晶形貌，断裂延伸率较低，为脆性断裂，没有塑性变形。Zn-0.5Mg合金表现出韧窝断裂特征，与纯Zn相比，断裂伸长率提高了28±6%。Zn-1Mg合金塑性韧窝数目减少，解理面的优势证实了合金的宏观脆性和较低的断裂伸长率(11±1%)。Zn-Cu合金断口表现出韧性断裂行为，断裂伸长率较大，约为117%。脊线的大小表明，与Zn相比，Zn-Cu合金的显微组织更加细化，晶粒尺寸也比Zn-Mg合金更大。

图2.纯Zn、Zn-Mg和Zn-Cu合金的拉伸试验：(a)拉伸和显微硬度试验后得到的力学参数。(b)拉伸断口的SEM形貌。

纯锌和锌合金最具代表性的极化曲线如图3所示。所有材料的阴极区相似，但阳极区域随合金成分的不同而有所不同。Zn-3Cu和Zn-5Cu的钝化区不像Zn、Zn-0.5Mg和Zn-1Mg的钝化区那样明显。Zn-5Cu的钝化区比其他材料的要小得多，在−1.0V左右，钝化层明显击穿。在Ecorr以上，Zn-3Cu和Zn-5Cu的电流密度不断增加，表明在这些合金上形成的钝化层的保护作用不如在Zn和Zn-Mg合金上形成的钝化层。此外，Zn-Mg合金表现出比Zn-Cu合金和纯Zn更高的阳极电流密度(参见表1中的icorr)。从动电位曲线计算出的所有样品的CR约为0.03 mm/年(参见表1中PDP测试的CR)。

图3.在37±1°C下，Zn、Zn-0.5Mg、Zn-1Mg、Zn-3Cu和Zn-5Cu在Hanks溶液中的动电位极化曲线。

表1.从动电位极化测试中获得的腐蚀参数(Ecorr、icorr 和 CR)，并通过在37±1°C和pH7.4的Hanks溶液中浸泡10天后的重量损失来计算腐蚀速率。

腐蚀样品去除腐蚀产物前后的SEM图像如图4所示。腐蚀表面的SEM图像显示纯Zn（图4a）和Zn-5Cu（图4i）具有类似的圆形特征。Zn-0.5Mg合金将这些圆形晶体与典型羟基磷灰石形貌结合在一起（图4c），Zn-1Mg合金形成了均匀的腐蚀层（图4e）。Zn-3Cu合金的腐蚀产物聚集在特定区域，表现出局部腐蚀（图4g）。去除腐蚀产物后，显示出均匀的纯锌腐蚀表面（图4b）。另一方面，锌基体和合金的第二相之间的微电偶活性证实了电偶腐蚀机制。Zn-Mg合金腐蚀表面的SEM图像（图4d，f）表明Zn-Mg2Zn11共晶在所有表面上的降解速度比Zn基体更快。相反，Zn-Cu合金显示出几乎无钝化的区域和其他具有局部腐蚀的区域，其中Zn基体的降解优于ε-CuZn5相（图4h，j）。

图4.腐蚀样品在37°C的Hanks溶液中浸泡10天后的扫描电镜图像，去除腐蚀产物之前(左)和之后(右)：Zn(a, b)，Zn-0.5Mg(c, d)，Zn-1Mg(e, f)，Zn-3Cu(g, h)和Zn-5Cu(i, j)。

图5显示了在研究样本上培养2小时后粘附的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的形态的扫描电镜图像。金黄色葡萄球菌与样品接触2h后未见形态改变。然而，与纯Zn相比，附着在Zn-Mg合金上的细菌数量增加了(图5a，c，e)。另一方面，金黄色葡萄球菌在Zn-Cu合金(图5g，i)上的粘附率要低得多，尤其是Zn-5Cu合金对金黄色葡萄球菌表现出较好的抗粘附性。此外，还观察到了Zn-5Cu表面降解的局部迹象(图5i)。对铜绿假单胞菌的粘附研究表明，培养后细胞形态保持完好。与纯Zn相比，附着在Zn-Cu合金表面的细菌数量较少(图5h，j)。此外，还观察了Zn和Zn-Mg合金与铜绿假单胞菌孵育后的表面形态变化。扫描电镜图像显示，与光滑部分相比，铜绿假单胞菌在锌和锌镁合金降解区域的粘附率更高(图5b，d，f)。未降解的Zn-5Cu表面未发现粘附细菌(图5j)。

图5. 金黄色葡萄球菌(左)和铜绿假单胞菌(右)在纯Zn(a, b)，Zn-0.5Mg(c, d)，Zn-1Mg(e, f)，Zn-3Cu(g, h)和Zn-5Cu(i, j)上培养2小时后细菌形态的扫描电镜图像。比例尺：20μm，黄色箭头表示铜绿假单胞菌。

图6显示了HAoEC与金属提取物间接接触的细胞毒性测定结果，金属提取物是在生长培养基中孵育合金样品3天得到的。活性结果表明，锌及其合金对HAoEC具有细胞毒性。根据ISO 10993-5，细胞活力降低超过30%被认为具有细胞毒性。由于我们将活性作为阳性对照组的比率来衡量，低于70%的值表示细胞毒性。在未稀释和稀释50%的提取物中培养的细胞就是这种情况。对于1：10v/v以下的稀释液，没有明显的细胞毒作用，尤其是Zn-Mg合金。在含铜合金中，Zn-5Cu具有细胞毒性。

图6.将合金在生长培养基中浸泡3天得到的上清液培养细胞24小时后的间接HAoEC活性。将浓度降低的上清液等分加入贴壁细胞。

为了进一步研究合金的细胞毒性效应，在实验的第1、3、7天用扫描电镜观察细胞的形态，在第7天用共聚焦显微镜观察细胞的分布。图7描绘了不同材料上HAoEC形态的图像。在整个浸泡过程中，细胞在Zn(图7a-c)和Zn-0.5Mg(图7e-g)上表现出扩散的形态。这种形态表明细胞与表面的粘附良好；然而，从Zn（图7d）和Zn-0.5Mg（图7h）的活/死共焦图像中观察到的细胞数量较低。在Zn-1Mg和Zn-Cu合金(图7i，m，q)中，HAoEC倾向于聚集成束。在健康细胞的情况下，这种束可能是局部细胞增殖的迹象。然而，目前的情况可能并非如此。锚定依赖性细胞在无法附着在下层表面时会相互附着以生存。Zn-1Mg(图7j和k)和Zn-Cu(图7n-o，r-s)合金分别在第3天和第7天观察到局部腐蚀产物的形成，而所有材料在第1天观察到相当平滑的腐蚀层。

图7.在Zn(a)-(d)、Zn-0.5Mg(e)-(h)、Zn-1Mg(i)-(l)、Zn-3Cu(m)-(p)和Zn-5Cu(q)-(t)上培养1天(左栏)、3天(第二栏)和7天(第三栏)后HAoEC的形态和分布的SEM(10μm标尺)和共聚焦(100μm标尺)图像。

本研究对Zn、Zn-0.5Mg、Zn-1Mg、Zn-3Cu和Zn-5Cu合金的力学性能、腐蚀性能和生物相容性进行了全面的研究，为选择合适的支架材料奠定了基础。拉伸力学测试和维氏硬度分析证实，Mg或Cu合金化显著提高了Zn的YS和UTS。断口图像与拉伸试验结果一致，显示了被测材料之间晶粒尺寸的差异。动电位测试结果表明，Zn-Mg合金的腐蚀层比Zn-Cu合金表面形成的腐蚀层具有更强的保护作用。细胞毒性实验表明锌及其合金对HAoECs具有细胞毒性。扩散和粘附试验表明，金黄色葡萄球菌对Zn-Mg合金具有更强的韧性，与Zn-Cu合金上的这种菌株不同。体外实验证明了Zn-Mg和Zn-Cu合金功能化的必要性。在受试材料中，Zn-1Mg对心血管支架的力学性能和降解性能表现出最好的水平。

02、论文第一/通讯作者简介

第一作者：Claudia García-Mintegui

Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Technical University of Catalonia (UPC), Barcelona East School of Engineering (EEBE), 08019, Barcelona, Spain

Resource Recovery and Environmental Management Group, UPC, EEBE, 08019, Barcelona, Spain

Barcelona Research Center in Multiscale Science and Engineering, UPC, EEBE, 08019, Barcelona, Spain

通讯作者：Marta Pegueroles

Biomaterials, Biomechanics and Tissue Engineering Group, Department of Materials Science and Engineering, Technical University of Catalonia (UPC), Barcelona East School of Engineering (EEBE), 08019, Barcelona, Spain

Barcelona Research Center in Multiscale Science and Engineering, UPC, EEBE, 08019, Barcelona, Spain

03、资助信息

这项研究获得了西班牙政府MINECO/FEDER(RTI2018-098075-B-C21)和加泰罗尼亚政府行政管理局和研究资助机构(2017SGR-1165)的财政支持。感谢COFUND计划(GA 712754)和SEV- 2014-0425(2015-2019)的资金支持。

04、原文信息

C. García-Mintegui, L.C. Córdoba, J. Buxadera-Palomero, A. Marquina, E. Jiménez-Piqué, M.P. Ginebra, J.L. Cortina, M. Pegueroles∗, 

Zn-Mg and Zn-Cu alloys for stenting applications: From nanoscale mechanical characterization to in vitro degradation and biocompatibility, 

Bioactive Materials 6(12) (2021) 4430-4446. 

doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.04.015