复方穿心莲片HPLC指纹图谱研究

 

黄炜忠1，毛鑫1，黄俊忠2，乔莉2，滕云霞1，张飞宇1，李华2

 

（1. 广东罗浮山国药股份有限公司，广东惠州 516133；

 

2. 广东省药品检验所，国家药品监督管理局药品快速检测技术重点实验室，

 

广东省生物医药科技协同创新中心，广州 510663）

 

摘要  目的：建立复方穿心莲片指纹图谱研究方法，为复方穿心莲片的质量标准提出修订建议。方法：采用Thermo scientific Syncronis aQ C18（4.6 mm×250mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱；以270nm为检测波长，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min-1，建立复方穿心莲片指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对市售65批次复方穿心莲片进行相似度评价。结果：建立的复方穿心莲片指纹图谱共确定6个共有峰，65个批次相似度在0.449～0.994之间且差异较大，平均值为0.927，考虑到药材的来源及大生产带来的影响，认为供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90较为合理。结论：本方法稳定可控，可用于复方穿心莲片的质量控制。

 

关键词：复方穿心莲片；质量标准；指纹图谱

 

Fingerprint analysis of compound Andrographis paniculate

 

tablets by HPLC*

 

HUANG Weizhong1，MAO Xin1， HUANG Junzhong2， QIAO Li2， TENG Yunxia1，

 

ZHANG Feiyu1，LI Hua2**

 

（1. Guangdong Luofushan Sinopharm Co.，Ltd.， Huizhou 516133，China；

 

2. Guangdong Institute for Drug Control，Key Laboratory of Rapid Drug Testing

 

Technology of the State Drug Administration，

 

Guangdong Biomedical Technology Collaborative Innovation Center， Guangzhou 510663，China）

 

Abstract  Objective： To establish a fingerprint analysis of compound Andrographis paniculate tablets （CAT）， and to propose amendments to the quality standard of CAT. Methods： The fingerprint of CAT was established using a Thermo Scientific Syncronis aQ C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with a gradient elution of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution  delivered at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 270 nm and column temperature was 30  ℃. The similarity evaluation of 65 batches of CAT was tested using the “Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system （2012 version）”. Results：A total of 6 common peaks were identified in the fingerprint spectrum of CAT. The similarity of 65 batches varied greatly from 0.449 to 0.994 with an average value of 0.927. Considering the source of the herb and the impact of large-scale production，the similarity between the fingerprint of the test product and the comparison fingerprint should be no less than 0.90. Conclusion： This method is stable and control lable，and can be used for the quality control of CAT.

 

Key words：  compound Andrographispaniculate tablets; quality standard;  fingerprint analysis

 

复方穿心莲片是由穿心莲和路边青两味中药组成，其中穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata （Burm. f.）Nees的干燥地上部分，路边青为马鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.的干燥地上部分；功能清热解毒，凉血，利湿。用于风热感冒，喉痹，痄腮，湿热泄泻等[1]。该品种现行质量标准为《卫生部药品标准中药成方制剂》第十九册WS3-B-3624-98，当前质量控制项目仅有性状、鉴别、检查三项，难以全面有效的控制本品质量。

 

目前，针对穿心莲的研究较为深入，现代研究表明穿心莲的二萜内酯类成分为其主要的活性成分，其中以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量最高，因此二者被《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）、EP、USP等多个国家、地区药典作为指标成分，控制穿心莲药材的质量[2-6]。另一方面，由于路边青药材未被《中国药典》收载，且化学研究薄弱，缺乏质量控制指标，目前仅有该品种根部的含量测定研究报道[7]。基于当前穿心莲和路边青的研究现状，本实验拟建立指纹图谱检测方法，以期全面控制复方穿心莲片的质量。

 

1  实验材料

 

1.1  仪器

 

岛津高效液相色谱仪（LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，CTO-10ASvp柱温箱，SPD-M20A检测器，CBM-20A控制器）；安捷伦1200高效液相色谱仪；赛默飞U3000高效液相色谱仪；双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Unique-R20超纯水仪（广州誉为生物科技仪器有限公司）；AB135-S十万分之一天平（Mettler Toledo 公司）；ML204万分之一电子天平（MettlerToledo 公司）。

 

Thermo scientific SyncronisaQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；Welch Materials Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；Phenomenex Kinetex C18 100A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

 

1.2  试剂

 

穿心莲对照药材（批号：121082-201706）、路边青对照药材（批号：121227-201305）、脱水穿心莲内酯对照品（批号：110854-201710），均购于中国食品药品检定研究院。路边青药材，批号：C125190801，产地：广东，购自遂溪县海图药业有限公司；穿心莲药材，批号：C032191114，产地：广东，购自雷州市芝兰农业种植专业合作社。

 

甲醇、磷酸均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

 

1.3  样品

 

本研究收集了全国市场上常见的17个厂家共65个批次的复方穿心莲片样品。

 

2  方法与结果

 

2.1  色谱条件

 

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～15min，2%→10% A；15～85min，10%→35% A；85～100min，35%→60% A），检测波长为270 nm。

 

2.2  对照品溶液的制备

 

取脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。

 

2.3  供试品溶液的制备

 

取本品5片，除去包衣，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，称定质量，超声处理（功率550 W，频率45 kHz）45 min，放冷，再次称定质量，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

 

2.4  指纹图谱的建立

 

2.4.1  共有峰的确认

 

对市售17个厂家共65个批次复方穿心莲片样品按照供试品溶液制备方法处理，按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图，根据色谱峰位置固定且易于辨认的原则，选定了6个色谱峰作为特征峰。进一步选择其中16个厂家共33批代表性批次，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件生成对照图谱，如图1所示。

 

2.4.2  色谱峰指认

 

取穿心莲及路边青对照药材及脱水穿心莲内酯对照品，按照供试品及对照品溶液制备方法处理，按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图，根据色谱峰的保留时间信息，对指纹图谱的共有峰进行归属。6个共有峰中：1号、3号、4号峰归属于穿心莲药材；2号、5号、6号峰归属于路边青药材，其中4号峰为脱水穿心莲内酯，见图2。

 

 

2.5  方法学考察

 

2.5.1  稳定性试验

 

取同一批供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、18、24、36、48 h按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图。以脱水穿心莲内酯为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得1～6号共有色谱峰的相对保留时间RSD分别为0.09%、0.06%、0.06%、0.00%、0.01%及0.01%，共有峰的相对峰面积RSD分别为0.32%、0.50%、0.34%、0.00%、0.86%以及0.34%；采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件进行处理，8次进样的图谱与对照图谱相似度均为1.000，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

 

2.5.2  重复性试验

 

取同一批样品，精密称定6份，制备供试品溶液，按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图。以脱水穿心莲内酯为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得1～6号共有色谱峰的相对保留时间RSD分别为0.04%、0.04%、0.03%、0.00%、0.01%以及0.01%，共有峰的相对峰面积RSD分别为0.28%、0.17%、0.19%、0.00%、0.72%以及0.20%；采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2010版）”软件进行处理，6份样品的图谱与对照图谱相似度均为1.000，结果表明方法的重复性良好。

 

2.5.3  色谱柱考察

 

取同一批供试品溶液，使用三种不同色谱柱，按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图。对比不同色谱柱测得的三个色谱图发现，不同色谱柱所对应的6个共有峰保留时间有所差异，但是色谱峰的分离度较好，峰面积及相对位置较为固定。结果如图3所示。

 

 

2.5.4  制剂与药材色谱峰对比

 

采用穿心莲药材、穿心莲干膏（按复方穿心莲片工艺制备）、路边青药材、路边青干膏（按复方穿心莲片工艺制备）与复方穿心莲片，按照供试品制备方法处理，按拟定的指纹图谱方法进样，记录色谱图，经过对比发现，穿心莲及路边青药材在制成干膏前后色谱峰的峰面积及色谱峰的数量均有所变化，但各药材相应的特征峰的保留时间相对固定，结果如图4所示。

 

 

2.6  相似度评价

 

测定结果及限度制定 将65个批次样品与对照指纹图谱比较，除62～65批次样品5号特征峰缺失导致无法计算相似度，其余批次与对照指纹图谱的相似度在0.449～0.994间，计算相似度的平均值为0.927，考虑到药材的来源及大生产带来的影响，认为将本品与对照指纹图谱的相似度限度应大于0.90较为合理。

 

3  讨论

 

路边青药材研究基础薄弱，文献研究发现其经常与蔷薇科植物路边青（Geum aleppicum Jacq.）混淆[8-10]。路边青的化学成分主要有萜类、黄酮类、生物碱类等主要成分[11]。马建中等发现“山大青苷”，但关于山大青苷文献极少，主要集中在利尿即降血压方面的药理研究，1994年后无相关研究，且未发现其对照品[12-15]。李艳等测定了山大青根（即路边青的根）中腺苷和丁香树脂酚葡萄糖苷的含量[7]，由于检测的药用部位不同，且腺苷与丁香树脂酚葡萄糖苷的药理活性与路边青功能主治不一致，因此这两种成分对路边青的质量控制参考意义不大。

 

复方穿心莲片的现行质量标准要求偏低，市售药品质量参差不齐，难免出现以次充好等现象，难以保证药品质量，不利于市场良性竞争，因此有必要对现行标准进行提高，确保药品质量并规范市场行为。目前已有研究者对穿心莲制剂的薄层色谱及含量测定方法进行了探索[16-18]，本研究则进一步针对其指纹图谱进行深入研究。根据样品与对照图谱的相似度应>0.90这一标准，共有7个厂家共13个批次的样品不符合要求。进一步对样品进行研究分析，部分样品指纹图谱与对照图谱比较，特征峰的峰面积明显偏小；其中来自同一厂家的2个批次值得特别关注，此两个批次的指纹图谱中4号脱水穿心莲内酯峰与对照图谱比较明显偏高，而其余5个特征峰则与对照图谱比较相对偏低。

 

本研究建立的指纹图谱具有一定的局限性，主要表现为特征峰的成分指认存在一定不足，研究中使用穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、新穿心莲内酯以及1，4-去氧穿心莲内酯四个标准品对特征峰进行了指认，发现穿心莲内酯、新穿心莲内酯以及1，4-去氧穿心莲内酯在270nm波长处均无明显吸收，最终仅确定了4号特征峰为脱水穿心莲内酯，更多特征峰的指认还需要进一步研究。

 

本研究建立的复方穿心莲片指纹图谱，方法稳定可控，有利于全面控制复方穿心莲片的质量。建议复方穿心莲片质量标准增加指纹图谱项，从而保证药品质量，规范市场行为，促进公平竞争。

 

参考文献

 

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