定量分析比较常用的定量方法：

 

① 面积归一化法

 

（可确定大概浓度，误差大）

 

② 矫正面积归一化法

 

（用响应因子对峰面积修正）

 

③ 内标法

 

④ 外标法

 

⑤ 混标

 

面积归一化法

 

若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：

 

 

 

不需要标样

 

组分的灵敏度相近

 

得到大致浓度（不能用于精确定量）

 

校正归一化法

 

【推导】

 

 

 

用校正因子进行修正后，再面积归一化

 

 

需要所有组分的标样

 

内标法

 

在待测的样品中准确加入一定量的内标物，根据被测物和内标物的量及其在色谱图相应的峰面积，确定此被测组分的含量。

 

原理:利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。

 

应先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得定量响应因子或校正因子，然后再根据峰面积对样品定量。

 

优点：进样量不严格要求，已消除系统误差。

 

缺点：

 

1）每次需要准确称量内标物和样品。

 

2）必须加一个组分进到样品，有可能增加面积测量误差。

 

3）严格选择内标物质。

 

 

需要标样和内标物。

 

目标组分和内标物被检测到，就可定量。

 

可减小进样量的误差对结果的影响。

 

【定量结果最为准确】

 

内标物必须准确添加入所有未知样品中。

 

外标法（标准曲线法）

 

1.用于常规分析

 

2.应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分没有重叠时，可用此法。

 

3.优点：操作简单，计算方便。

 

4.缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。

 

（为提高精度，可将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。）

 

注意事项：

 

要求进样量必须完全一致，是属于绝对法。绝对响应值的使用也是要求进样量、色谱质谱分析操作条件严格不变。

 

检测方法：

 

配置一系列已知浓度的标样，浓度按从小大排列；

 

采集不同浓度标样的色谱图积分，按外标法定量计算，建立标准曲线；

 

 

特点：

 

无需各组分都被检出、洗脱

 

需要标样

 

标样及样品测定的条件要一致

 

进样体积要准确

 

 

校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误。

 

5.单点矫正：当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。即配置一个与被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，计算被测物的含量。

 

 

定量中的误差问题

 

• 样品的代表性（样品的前处理）

 

• 进样系统的影响 

 

• 柱系统的影响

 

• 测量误差 

 

• 定量结果的误差分析

 

HPLC定量时，如何应对非线性响应的检测器？

 

 

曲线A：因在0浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开；

 

曲线B：在此浓度范围内，检测器的响应是非线性的；

 

曲线C：可接受的理想状态（其延长线到0点）；

 

曲线D：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也可能是样品制备时损失。

 

非线性响应：测试当中，如果其输出不与其输入成正比,则它是非线性的.从数学上看,非线性系统的特征是叠加原理不再成立，需要做特殊处理。

 

 

在双对数坐标纸上，做响应值与组分量间的关系图

 

1）图中曲线的斜率为1±0.05时，为线性响应（A）；

 

2）斜率大于或小于1±0.05时（B、C），均为非线性响应。

 

案例：贝壳中提取物的定量

 

（非线性响应）

 

UHPLC测试条件

 

流动相：乙腈：0.05%三乙胺溶液=75：25，流速1ml/min

 

检测器：蒸发光散射（雾化60度，蒸发85度，灵敏度5，高等）

 

色谱柱：Supersil ODS2（4.6mm*25cm)

 

 

贝壳中贝母素A、B的HPLC测试图

 

 

贝母素A的曲线图

（浓度与峰面积）非线性

 

 

贝母素A的标准曲线图

（浓度对数与峰面积对数）