摘要  目的：建立同时分析测定大川芎口服液中3种活性成分（天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I）的方法。方法：采用HPLC法，色谱柱为资生堂Capcell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0mL·min-1；检测波长分别为269 nm，322 nm。结果：天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I线性范围分别9.525 0～381.00 μg·mL-1（r＝0.999 4），0.485 05～19.402 μg·mL-1（r＝0.999 9），2.1421～85.682 μg·mL-1（r＝0.999 9）；天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I回收率（n＝9）分别为93.9%、99.2%、99.8%，RSD均小于2.0%。结论：该法操作简单，重复性好，为控制大川芎口服液的质量提供可靠的方法。

 

关键词：大川芎口服液；梯度洗脱；HPLC

 

Abstract  Objective： To establish a method for the simultaneous determination of three active ingredients （gastrodin，ferulic acid， senkyunolide I） in Dachuanxiong Oral Liquids. Methods： The chromatographic analysis was performed on a Shiseido Capcell C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm）using a gradient elution of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution delivered at a flow rate of 1.0 mL·min-1 at wavelengths of 269nm and 322 nm. Results： The calibration curves were linear in the ranges of 9.525 0-381.00 μg·mL-1 for gastrodin（r＝0.999 4），0.485 05-19.402 μg·mL-1 for ferulic acid（r＝0.999 9），2.1421-85.682 μg·mL-1 for senkyunolide I（r＝0.999 9）. The recovery values of gastrodin，ferulic acid and senkyunolide I （n＝9） were 93.9%， 99.2% and 99.8%，respectively， and RSD values were less than 2.0%. Conclusion：The method is simple and repeatable，which can be applied to the quality control of Dachuanxiong Oral Liquids.

 

Key words：  Dachuanxiong Oral Liquids，gradient elution， HPLC

 

大川芎口服液由川芎、天麻经水煎、醇沉等工艺精制而成，具有活血化瘀，平肝熄风的功效。用于淤血阻络，肝阳化风所致的头痛、头胀、眩晕、颈项紧张不舒、上下肢或偏身麻木、舌部瘀斑[1]。现收载于《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2020年版一部，现行质量标准中含量测定项中仅对天麻的指标成分天麻素[1]进行控制，未控制川芎的有效成分，因此，建立简单、准确、针对多组分的分析方法至关重要。川芎中化学成分主要包括川芎嗪、阿魏酸和藁本内酯等化合物，川芎嗪一直被认为是川芎中的主要活性成分，但近期研究表明，川芎中的内酯类成分才是川芎的主要活性成分[2]，川芎内酯类化合物能通过血脑屏障，具有抗血小板聚集、扩张血管、抗脑缺血、减轻脑缺血损伤等作用。前期的研究中[3]，从川芎抗偏头痛效应组分中分离得到了藁本内酯的氧化衍生物洋川芎内酯I。血清药物化学研究表明，阿魏酸和洋川芎内酯I为川芎效应组分中入血的主要成分，洋川芎内酯I为既入血又入脑的成分[4]。因此，选择阿魏酸和洋川芎内酯I作为川芎的有效成分进行控制。目前，对大川芎口服液进行质量控制的文献较少，但有大川芎方制剂类质量控制的研究[5-6]，本文参考相关文献[7-8]，采用HPLC梯度洗脱法在同一色谱条件下对大川芎口服液中3种活性成分（天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I）同时测定，具有准确、简单、快捷的特点，可有效控制药品质量。

 

1  仪器与试药

 

1.1  仪器

 

Waters 2695-2998高效液相色谱仪；Phenomen HU10260B型超声波清洗器；Sartorius R200D型电子天平（十万分之一电子天平），Sartorius MSA6.6S-CE型电子天平（百万分之一电子天平）。

 

1.2  试剂及试药

 

天麻素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110807-201608，纯度为96.7%）、阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110773-201614，纯度为99.0%）、洋川芎内酯I对照品（南京金萌阳生物科技有限公司提供，批号为17121105，纯度为99.9%）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水；其它试剂为分析纯。

 

2  方法与结果

 

2.1  溶液的制备

 

2.1.1  对照品溶液

 

取天麻素对照品、阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1mL分别含100、5、20μg的混合溶液，即得。

 

2.1.2  供试品溶液

 

精密量取本品2 mL，置50mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

 

2.1.3  阴性样品溶液

 

按工艺方法制备缺天麻、缺川芎、同时缺天麻和川芎的阴性样品，并按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

 

2.2  色谱条件及系统适用性试验

 

色谱柱：资生堂Capcell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min，2%A；12～50 min，2%A→40%A）；流速1.0mL·min-1；检测波长：269 nm/322 nm；进样量：5 μL。理论板数按天麻素峰计算应不低于5 000，峰的分离度均大于1.5。在上述色谱条件下，样品中其他成分对天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I的测定无干扰。对照品、供试品及阴性样品色谱图见图1。

 

2.3  方法学验证

 

2.3.1  线性关系考察

 

精密称取阿魏酸对照品9. 799 mg，置100 mL量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为阿魏酸对照品溶液；精密称取洋川芎内酯I对照品10.721mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为洋川芎内酯I对照品溶液；精密称取天麻素对照品19.700mg，置50mL量瓶中，分别精密加入阿魏酸对照品溶液10 mL和洋川芎内酯I对照品溶液20mL，用70%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅴ。取此混合对照品溶液配制系列浓度混合对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ按“2.2”项下色谱条件进样测定，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I的回归方程分别为：

 

Y＝1 056.8X＋5 959.2  r＝0.999 4

 

Y＝26 209.5X＋1 348.8  r＝0.999 9

 

Y＝22 926.2X＋2 878.6  r＝0.999 9

 

结果表明天麻素在9.525 0～381.00 μg·mL-1、阿魏酸在0.485 05～19.402 μg·mL-1、洋川芎内酯I在2.1421～85.682 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

 

 

A. 对照品溶液（reference substance）（269 nm）  B. 供试品溶液（sample）（269 nm）  C. 缺天麻阴性液（negative sample without Gastrodiae elata Bl.）（269 nm）  D. 缺川芎阴性液（negative sample without Rhizoma chuanxiong）（269 nm）  E. 同时缺天麻川芎阴性液（negative sample without Gastrodia elata Bl. and Rhizoma chuanxiong）（269 nm）  F. 对照品溶液（reference substance）（322 nm）  G. 供试品溶液（test sample）（322 nm）  H.缺川芎阴性液（negative sample without Rhizoma chuanxiong）（322 nm）  I.空白溶剂（blank solvent）（269 nm）  1. 天麻素（gastrodin）  2. 阿魏酸（ferulic acid）  3. 洋川芎内酯I（senkyunolideI）

图1  HPLC色谱图

Fig.1  HPLC chromatograms

 

2.3.2  耐用性试验

 

分别考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃等3个柱温条件；资生堂CapcellC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、安捷伦ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和奥泰 Alltima C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）3根色谱柱，结果对各色谱峰分离及各化学成分含量无明显差异。

 

2.3.3  精密度试验

 

精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，结果天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I的RSD分别为0.9%，1.0%，0.8%。表明仪器精密度良好。

 

2.3.4  稳定性试验

 

精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、12、27h进样，结果天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I峰面积的RSD分别为1.0%，2.2%，2.3%。实验结果表明，供试品溶液制备后27 h内测定，待测组分天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I化学性质稳定。

 

2.3.5  重复性试验

 

取同一批号的大川芎口服液样品6份，每份2mL，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法试验，精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积，结果样品中的天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I含量平均值分别为4 328.5，122.37，400.40 μg·mL-1；RSD分别为0.9%，2.9%，1.0%。表明方法重复性良好。

 

2.3.6  回收率试验

 

精密量取已知准确含量的同一批样品9份各1.0 mL（分成低中高浓度3组，每组3份，分别含天麻素4 328.5μg，阿魏酸122.37 μg，洋川芎内酯I 400.40μ g），每份分别精密加入天麻素对照品溶液（精密称取天麻素对照品40.69 mg，置100 mL量瓶，以70%甲醇溶液稀释定容，浓度为393.47μg·mL-1），阿魏酸对照品溶液（精密称取阿魏酸对照品12.05 mg，置100 mL量瓶中，以70%甲醇溶液稀释定容，再取10mL，置100 mL容量瓶，以70%甲醇溶液稀释定容，浓度为11.930μg·mL-1），洋川芎内酯I对照品溶液（精密称取洋川芎内酯I对照品4.333mg，置100 mL量瓶中，以70%甲醇溶液稀释定容，浓度为43.287μg·mL-1）5 mL、10 mL、15mL，按照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制成准确度试验用供试品溶液，测定加标样品中的天麻素、阿魏酸、洋川芎内酯I的含量，计算回收率。结果见表1。

 

 

2.4  样品测定

 

取不同批号的大川芎口服液，分别按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样测定，以外标法计算含量，结果见表2。

 

 

3  讨论

 

3.1  检测波长的选择

 

兼顾3种成分紫外最大吸收波长以及各组分在制剂中的含量，并查阅现有的相关文献[9-13]，参照天麻素、洋川芎内酯I紫外全波长扫描结果，采用269nm波长处测定天麻素、洋川芎内酯I的含量；参照《中国药典》2020年版川芎含量测定项，采用322nm波长处测定阿魏酸的含量。

 

3.2 流动相的选择

 

分别考察了乙腈-0.05%磷酸溶液系统、乙腈-水系统，甲醇-0.1%冰醋酸溶液系统，结果以乙腈-0.05%磷酸溶液系统峰型较好，分离效果较理想。参照相关文献的液相洗脱条件，最终确定梯度洗脱条件，本试验采用梯度洗脱法在50 min内完成对3种成分的同时分析测定，缩短了分析时间。

 

3.3 小结

 

本文对处方中天麻及川芎的3个活性成分同时进行定量研究，可以整体反映大川芎口服液的产品质量，为该品种的质量监管提供技术支持。

 

参考文献

 

[1]  中华人民共和国药典.2020年版.一部[S].2020：520

ChP2020.VolⅠ[S]. 2020：520

[2]  LI HX，DING MY， Lü K，et al. Determination of the active ingredients in Chuanxiong by HPLC， HPLC-MS， and EI-MS[J]. J Liq Chromatogr RT，2001，24(13)：2017

[3]  WANG YH，LIANG S， FENG Y， et al. Effect and mechanism of senkyunolide I as an anti-migraine compound from Ligusticum Chuanxiong[J]. J Pharm， 2011，63(2)：261

[4]  袁莹，林晓，冯怡，等.川芎治疗偏头痛效应组分的体内移行研究[J]. 中国药学杂志，2010，45(9)：694

YUAN Y， LIN X， FENG Y， et al. In vivo Transmigration of anti-migrainous compounds from Ligusticum Chuanxiong Hort[J]. Chin Pharm J，2010，45(9)：694

[5]  陈炼明，刘洁，李乾，等.大川芎方制剂类天麻素类、苯酞类以及酚酸类成分测定方法研究[J]. 药物评价研究，2019，42(12)：2369

CHEN LM， LIU J， LI Q，et al. Study on determination method of gastrodin，phthalide and phenolic acid in Dachuanxiong prescription[J]. Drug Evaluat Res，2019，42(12)：2369

[6]  倪书茂，钱大玮，尚尔鑫，等.大川芎方化学成分的超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间质谱分析[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(1)：39

NI SM， QIAN DW， SHANG EX， et al. Analysis of chemical composition of Dachuanxiong Fang by ultra performance liquid chromatography-electro spray ionization-quadrupole time of flight/mass spectrometry [J]. Chin J Exp Tradit Med Form，2010，16(1)：39

[7]  张文静，王晓燕，李向阳，等.一测多评法同时测定妇科调经片中7个成分的含量 [J]. 药物分析杂志，2020，40(2)：329

ZHANG WJ， WANG XY， LI XY， et al. Determination of twelve components in chrysanthemum indicum by quantitative analysis of multi-components by single marker[J]. Chin J Pharm Anal，2020，40(2)：329

[8]  朱月梅，梁茂本，张沂.HPLC法测定天丹通络片中３种活性成分的含量[J]. 西北药学杂志， 2020，35(2)：213

ZHU YM， LIANG MB， ZHANG X. Determination of 3 active components in Tiandan Tongluo Tablets by HPLC[J]. Northwest Pharm J，2020，35(2)：213

[9]  田国贺，王坤，韩晓红.参茸天麻酒的质量标准研究和探讨[J]. 中国药品标准，2020，21(1)：26

TIAN GH，WANG K， HAN XH. Research and discussion on the quality standard of Shenrongtianma Medicinal Liquor[J]. Drug Stand China，2020，21(1)：26

[10]  杨秀丽，徐水琴. 天麻胶囊HPLC指纹图谱的建立和聚类分析[J].中国药师，2020，23(5)：853

YANG XL， XU SQ. HPLC Fingerprint and Cluster Analysis of Tianma Capsules[J]. China Pharm， 2020，23(5)：853

[11]  刘华明，沈心，周震宇.阿魏酸哌嗪片的含量和有关物质的测定[J]. 中国药品标准，2020，21(1)：69

LIU HM，SHEN X，ZHOU ZY. Determination of the related substances and assay of piperazine ferulate tablets by HPLC [J]. Drug Stand China，2020，21(1)：69

[12]  邱丹.HPLC法测定调经祛斑片中阿魏酸的含量[J]. 海峡药学，2020，32(4)：86

QIU D. Determination of ferulic acid in Tiaojing Quban Tablet by HPLC[J]. Strait Pharm J，2020，32(4)：86

[13]  熊耀坤，梁爽，洪燕龙，等.应用反相高效制备液相同时分离川芎中阿魏酸、洋川芎内酯I和H[J]. 中国中药杂志，2013，38(12)：1947

XIONG YK， LIANG S， HONG YL， et al. Preparation of ferulic acid， senkyunolide Ⅰ and senkyunolide H from Ligusticumchuanxiong by preparative HPLC[J]. China J Chin Mater Med，2013，38(12)：1947

 

《中国药品标准》杂志第22巻  第5期

施法1，董斌2，王天歌1，谭艳妮1，李成森3

（1. 沈阳市食品药品检验所，沈阳110122；2. 大连市药品检验检测院，辽宁大连 116021；3. 辽宁省检验检测认证中心 辽宁省药品检验检测院，沈阳 110036）

 

Simultaneous quantification of three active ingredients in Dachuanxiong Oral Liquids by HPLC

SHI Fa1，DONG Bin2， WANG Tiange1， TAN Yanni1， LI Chengsen3

（1. Shenyang Institute for Food and Drug Control， Shenyang 110122，China；2. Dalian Institute for Drug Control，Dalian 116021， China；3. Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）