水质分析中的微生物检测项目

壹、总大肠菌群检测 

1、大肠杆菌、总大肠菌群和粪大肠菌群如何区分？ 

（1）问题描述：

做海水大肠杆菌的检测，可是只找到了粪大肠菌群的检测。三种检测方法有什么不一样的？好多文献大肠杆菌用的就是总大肠菌群的检测方法，不知对结果会有多少影响？ 

（2）解答： 

三种检测方法是不一样的，大肠杆菌不该用总大肠菌群的检测方法，因为大肠菌群（总大肠菌群）>粪大肠菌群&耐热大肠菌群>大肠杆菌。 

①总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌；该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。 

②粪大肠菌群：是在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群，因检测方法比大肠杆菌简单地多，而受到重视；用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。 

③大肠杆菌：细菌门。细胞杆状，直径约1微米，长约2微米，两端钝圆，周身具鞭毛，可运动。

革兰氏染色阴性，不形成芽孢。菌落圆形，白色或黄白色，光滑而具闪光，低平或微凸起，边缘整齐。最适条件下培养20分钟可繁殖1 代。

大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，可能在肠中对合成维生素K起作用。

但它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。

感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。大肠杆菌的检验是以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于 8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。

稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15minLST和EC初步筛选：对每个样品选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。

每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h；观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中；将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内培养48±2h。 

2、检测总大肠菌群过程中，倒管操作的疑惑 

（1）问题描述：

第一步，乳糖发酵试验的时候，在开始培养的时候，小试管里面我感觉是一小试管的气，到底是液体还是气体啊？  

（2）解答： 

①放小倒管，目的是看培养后它是否产生气体。小倒管放进去要没有气泡，一开始放进去就有气泡不行的。可以先放小倒管，在加培养基。

你可以自己试验下，看自己操作哪种方式容易操作不会有气泡。小导管要清洗干净。小导管先加后加问题不大才对，灭菌以后小导管里面的空气可以排尽。这个过程，先放后放（放完里面有气泡）去灭菌完，看下效果。 

②倒管里面有气主要还是你灭菌的时候没有控制好，跟先倒培养基或者先放小倒管没有关系，注意在灭菌时候，时间到了不着急放气，等温度和压力自然降下来再取，另外就是灭菌的时候试管倾斜一定角度放灭菌锅里也有助于排气。

3、如何选择粪大肠菌群MPN法和滤膜法，以及两者的单位是否能转换？ 

（1）问题描述：

按照HJ/T 347，粪大肠菌群有两种监测方法，一种是MPN法，一种是滤膜法，现在碰到几个问题比较困惑，想请教一下：

①MPN法的单位是没有单位呢，还是MPN/L呢？

②包括GB 3838还是GB/T 14848等标准，反正是我看到过的所有对粪大肠菌群有限值要求的标准，都是以个/L做单位的，是不是就只能用滤膜法了或者MPN法也可以呢？ 

③根据地表水环境质量标准值中，粪大肠菌群的单位是“个/L”,但是多管发酵的最后单位是“MPN/100mL”及时最后计算是把MPN/100mL转化为"MPN/L"，那我在做最后的评价中，我要如何把MPN/L,和“个/L”进行评价。还是说，地表水的检测方法只能用滤膜法而不能用多管发酵法。 

（2）解答： 

①滤膜法、多管发酵法及酶底物法这3者之间检测总大肠菌群不具有可比性。滤膜法检测的是准确值，多管发酵法及酶底物法出具的是估计值。三者的检测原理不同，接种取样的量也不同。故3者之间不能相互转换或比对。 

②酶底物法单位是MPN/100mL，滤膜法是用个/L。MPN法的检出限2MPN/100mL不能简单等同于20个/L，否则按个/L计的检出限将大于 GB 5749标准的限值，这是不合逻辑的。但检测结果中，可以用MPN/100mL乘以10便转化为“个/L”。 

贰、其他 

1、生化培养箱和电热培养箱有什么区别？

（1）问题描述：

科里上周买了一台培养箱，当仪器管理员打开后才发现，里面是电热培养箱，但我们的采购单上写的是生化培养箱，这两者有什么区别吗？我们退货的时候理由是电热培养箱是培养细菌的，生化培养箱是培养五日的。是这么回事吗？

单位只有三个培养箱，因为有时候微生物需要不同的培养温度，所以三个培养箱都在用，BOD培养也在用。今天内部检查，说使用记录上不能体现微生物培养和BOD培养混用培养箱。微生物要么不写，要么写在同一个培养箱的使用记录上。

就算混用违规，难道体现违规比体现作假的后果更严重吗？微生物整个分析过程就一个培养使用记录，没有培养记录，那数据怎么出来？各位老师，有相关资料表明这两种情况不能混用培养箱吗？ 

（2）解答： 

生化培养箱有制冷功能，电热培养箱没有制冷功能，当环境温度高于培养箱内的工作温度时，生化培养箱仍然能够保持它的工作温度，而电热培养箱的热由于环境温度过高而散不出去，所以就会出现频繁的报警。 

①两者工作原理不同，生化培养箱主机部分是压缩机的可制热和制冷（和空调一样），可工作在室温上或室温以下。电热培养箱靠电热丝加温，只能工作在室温以上。 

②《评审准则》是这样规定的：

依据相关的规范、方法和程序要求，当影响检验检测结果质量情况时，应监测、控制和记录环境条件。对诸如生物消毒、灰尘、电磁干扰、辐射、湿度、供电、温度、声级和振级等应予重视，使其适应于相关的技术活动要求。当环境条件危及到检验检测的结果时，应停止检验检测活动。 

检验检测机构应对影响检验检测质量的区域的进入和使用加以控制，可根据其特定情况确定控制的范围。

应将不相容活动的相邻区域进行有效隔离，采取措施以防止交叉污染。应采取措施确保实验室的良好内务，必要时应建立和保持相关的程序。 

因此评审时有老师就要求微生物和BOD的培养箱和压力锅必须分开，如果你要不分开就得举证，通过检测空白菌落的方法来证明合用没有影响来说服老师。 

不过要是用BOD培养箱来做细菌培养的话，还真的不可以，因为BOD培养箱的控温精度是1℃，不能满足粪大肠菌群发酵0.5℃的培养控温精度要求。另外，温度显示的分辨率（最小读数单位）不等于控温的准确度（温度误差），这个指标要看培养箱说明书和铭牌上的温度误差和温度均匀性指标。 

2、水厂化验室建无菌室需要哪些仪器设备？ 

（1）问题描述：

主要做大肠菌群的日处理6～7个样品，也不是很多。就是普通污水厂化验室建无菌室需要用到的设备就行了。申请环境监测业务建设微生物室，做细菌，大肠杆菌，粪大肠菌，需要购买哪些仪器和器皿？ 

（2）解答： 

化验室只测大肠菌群的话，不用很多设备，要求也不必太严，但是房间要是套间，外面是缓冲间，十万级菌检室需带更衣间。

无菌区要安装紫外灭菌灯，仪器设备要有电热恒温培养箱、隔水式恒温培养箱，高压灭菌锅可以放在其他房间。

其他的设备有显微镜,无菌操作台,低功率紫外灯，pH计，培养基，培养皿，温度计，可净化空调，洁净操作台，水浴锅，洁净服，镊子，有关试管等。 

3、如何做好微生物检测的环境控制？ 

（1）问题描述：

不知道各位检测微生物的版友们怎么做微生物检测室的质控，我们好像是在检测室的四角放培养皿，然后进行培养，有没有类似的？正确的操作应该是怎么做呢？ 

（2）解答： 

①概述 

无菌室的菌落空白的多少关系细菌指标的检测质量。通常无菌室是在微生物实验室内专辟一个小房间，可以用塑料板材、玻璃或复合材料整体建造。面积不宜过大，约4～6平方米即可，高2.7米左右，不得有窗（传递窗除外）和容易积尘的物件。

无菌室外要设一个缓冲间，无菌室和缓冲间都必须密闭。室内必须有超净工作台。超净工作台其主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃。通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气的控制之下。 

②技术要求

空白值平均菌落数：100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平均不得超过3个菌落。      

③检验条件

a.检验时环境条件

供电电源：220V±22V,50±1Hz

环境温度（10～30）±2℃ 

环境湿度：≤85％ 

b.检验用的设备：SW—CJ型超净工作台，DH4OOOB-电热恒温培养箱。

④检验项目和检验方法

a.项目：平均菌落数     

b.方法 

打开紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并同时打开超净台进行吹风。操作完毕，应及时清理无菌室，再用紫外灯辐照灭菌20分钟。 

在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15mL，放至凝固后，倒置于30～35℃培养箱培养48小时，证明无菌后，取平板 3～5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30分钟后，倒置于30～35℃培养箱培养48小时，取出检查并记录。 

所有平皿菌落数的均值即为平均菌落数，应该满足上面的技术要求，如不满足要求应对无菌室进行彻底消毒，重复检查，直到满足上面的技术要求为止。 

⑤检验结果处理及周期

a.检验记录表中各项技术指标满足要求，准许使用；不满足的，不得使用。

b.检验周期不超过6个月。