微生物限度检查包括微生物限度计数（用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数)及控制菌检查（用于在特定试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物）。微生物限度试验广泛应用于评估非灭菌制剂及原料、敷料是否符合药典的规定，指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，指导生产过程中间产品微生物质量的监控等。各个国家颁布了一系列的标准来规范微生物限度，例如《中国药典》通则1105，《中国药典》通则1106，《美国药典》通则61，《美国药典》通则62，对微生物限度检测方法及结果判定提供了指导。下面，我们与大家共同探讨一下微生物限度的相关内容。

01微生物限度检查的内容有哪些？

1）微生物限度计数

计数方法适用性试验

供试品的微生物限度计数

2）微生物限度控制菌检查

控制菌检查方法适用性试验

供试品微生物限度控制菌检查

02微生物限度计数方法适用性试验

计数方法适用性试验是为了确认所采用的方法是否能有效地回收产品上/产品内的微生物。下面我们来共同了解一下。计数方法适用性试验的流程：

供试液制备

依据样本的特性，选择适宜的样本稀释液，将供试品制备成1:10的供试液，必要时用同一样本稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂可以使用混合的样品原液作为供试液。

接种

向制备的供试液中接种测试微生物，计数方法适用性试验的测试菌株包括：金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌和黑曲霉。按照下列方法对不同的组别进行接种，需要注意的是，每种微生物需分别进行接种。

测试组：供试液+菌悬液(菌悬液体积不大于供试液体积的1%)

供试液对照组(阴性对照)：供试液+样本稀释液

菌液对照组(阳性对照)：样本稀释液+菌悬液(同测试组)

注：需确保接种后每毫升供试液或每张滤膜上的菌数小于100CFU。

微生物回收

接种后可采用下列方法对供试液中的微生物进行回收：

平皿法(倾注法)：向无菌平皿中加入1mL测试溶液，注入15~20mL相应培养基，混匀后静置，待培养基凝固后置于相应条件下培养。

平皿法(涂布法)：向含有相应培养基的平板中加入不少于0.1mL的测试溶液，使用涂布器涂布均匀，置于相应条件下培养。

薄膜过滤法：使用孔径0.45μm的微生物限度滤膜过滤适宜体积的测试溶液，然后使用洗脱介质冲洗滤膜，每次冲洗量不超过100mL，最多不超过1000mL。然后将滤膜置于相应的培养基上培养。

MPN法：MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，且MPN法不适用于霉菌计数。

注：当回收率无法达到要求时，可采用以下方法消除供试品的抗菌活性：

1）增加样本稀释液或培养基的体积；

2）向样本稀释液或培养基中加入抗菌物质的中和剂或灭菌剂；

3）采用薄膜过滤法通过过滤去除某些中和剂或灭菌剂；

4）上述几种方法联合使用。

接受准则

试验组菌落数减去供试液对照组(阴性对照)菌落数与菌液对照组(阳性对照)菌落数的比值应在0.5~2范围内。

微生物限度计数

测试组使用与计数方法适用性试验相同的方法进行供试液制备，微生物回收和计数。使用空白样本稀释液作为阴性对照，使用与测试组相同的方法进行微生物的回收和计数，阴性对照应无菌生长。

03控制菌检查方法适用性试验

控制菌检查方法适用性试验是为了确认所采用的方法能有效检出产品上潜在的控制菌。控制菌检查方法适用性试验包含以下几个流程：

控制菌检查方法适用性试验的供试液制备同计数方法适用性试验，接种的微生物为目标控制菌的阳性菌株，接种后在进行不同种类的控制菌检查时，所使用的增菌培养基和分离鉴定方法不同。下面列举了各种控制菌检测所使用的培养基或分离鉴定方法。

微生物限度控制菌检查

使用与控制菌检查方法适用性试验相同的方法进行供试液制备，增菌培养分离鉴定和观察。以空白样本稀释液代替供试液作为阴性对照，阴性对照应无菌生长；向供试液加入≤100CFU对照菌作为阳性对照，阳性对照应检出相应控制菌。