一、考察离子化合物的pKa值

　　在反相色谱分析中通常不要求化合物精确的pKa值，我们可以通过查阅文献或者根据化合物的结构按照下图中列出的主要酸碱官能团在水溶液的pKa值进行推测。

　　注意：按照上表中官能团进行估算时分子中相邻基团的不同会导致pKa出现1-2个单位的差异。对于酸性化合物，当含有吸电子基团时会导致酸性增强，pKa值相应降低;对于碱性化合物，当含有吸电子基团时会导致碱性降低，pKa值相应降低。

二、根据化合物pKa值推测流动相相应使用的pH

　　先看下流动相pH对酸碱化合物的影响：流动相pH对不同pKa化合物的保留时间的影响

　　根据这幅图，我们可以看出，当流动相的pH约等于化合物的pKa时，可以最大限度的调整化合物的保留时间。此时改变0.1个单位的pH可以使得保留因子k变化10%，可引起分离度±2.5个单位的变动。但此时需要进行精确控制流动相的pH，这要求把流动相pH控制在0.02个单位以内，在实验室很难控制，重现性较差，成为分析的瓶颈。

　　但我们实验时可以将pH范围放宽，只要将流动相pH控制在化合物pKa值±1.5个单位的范围内(上图所示的II范围内)就可以对化合物保留行为产生比较明显的影响，此时进行分离选择性较好。同时为了更好地控制保留行为的重现性，需要控制缓冲液的pH在±0.1个单位以内(当流动相pH控制范围较窄时建议使用缓冲盐的质量进行控制，比pH计进行控制效果更优)。

　　通过以上三点分析我们可以得出，待分析化合物的pKa与确定流动相的pH有很大的关系。主要依据化合物出峰时间、化合物的峰型及所需要分离目标的化合物综合考虑来确定流动相的pH。

　　可能有的同事会发现第二点和第三点是有些矛盾的，这时候就需要对自己的实验进行初步的探索，看看是否pH值会对化合物的峰型产生影响(有的专家认为该观点缺乏理论和实践的支持)或者是否需要准确调节pH在化合物pKa±1.5范围内进行提高选择性。

　　笔者在做实验时发现有的物质会因稀释液pH使用不当产生峰分叉的现象，调节稀释液的pH即可解决峰的分叉;有时流动相pH在化合物的pKa±2的范围内时离子化合物并没有出现峰分叉、峰型不好现象。

三、根据流动相pH值测定所需要的缓冲盐

　　1.缓冲液选择主要依据：

　　(1)缓冲溶液的pKa和缓冲容量

　　(2)溶解度

　　(3)紫外吸收

　　2.对以上三点进行说明

　　(1)一般缓冲溶液的pKa值与流动相的pH相等时缓冲能力最大，pKa与流动相的pH相差越大，缓冲液的缓冲能力越差。一般要求流动相的pH与缓冲液的pKa值不能超过±1.0个单位，当缓冲溶液浓度较高时可以放宽范围到1.5个单位。常用的缓冲液的缓冲范围见下图：

　　缓冲溶液的浓度一般在5-50mmol，因过低导致缓冲能力不足(可通过调整进样体积查看化合物峰型的变化，如果出现拖尾或者前沿现象，说明缓冲溶液的能力不足);缓冲液浓度过大会导致与有机相混溶时盐的析出，对仪器、色谱柱都会产生损伤，而且使得基线不好。一般初始摸索方法时推荐使用25mmol。

　　(2)根据缓冲液溶解度：在酸性缓冲溶液中，如磷酸盐，缓冲液溶解度顺序：钠盐<钾盐<铵盐;有研究发现，当pH=7时10mmol的磷酸钾在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3时，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解(此测试通过使用容器将不同比例的混合溶剂进行混合，观察大约30min，是否有沉淀产生，否则就要降低缓冲液的浓度或者有机相的含量，在梯度洗脱时尤为注意)。

　　(3)根据化合物的吸收波长：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸盐缓冲液是不错的选择。而甲酸盐和乙酸盐缓冲液的范围是2.5～6.0，适用于210纳米或者更高吸收的检测波长。

　　3. 缓冲盐的作用：

　　缓冲盐的种类或者浓度对选择性的改变会很小，只是起到缓冲作用，提高化合物的保留时间的稳定性。

　　高效液相色谱法中选择缓冲盐的注意事项

　　在高效液相色谱法中，分离酸或碱缓冲溶液对维持流动相恒定pH和提高保留时间的重现性都非常重要。

　　怎么选择缓冲液：

　　● Pka和缓冲容量

　　● 溶解度

　　● 紫外吸光度(使用UV检测器)

　　● 挥发性(MS蒸发光散射检测器)

　　● 离子对性质

　　● 稳定性和仪器的兼容性

　　根据以上的理论，流动相缓冲容量取决于缓冲盐的pka，缓冲盐浓度，流动相pH。

　　当缓冲液中溶质的的两种形态(HA和 A-)浓度相等时，即缓冲盐的pka与流动相pH相等时，缓冲能力最大。当流动相的pH与缓冲盐的pka相差越大，缓冲盐的缓冲容量就越小。因此缓冲的pka与流动相的pH相差不能超过±1.0个单位。

　　流动相的缓冲容量一般与缓冲液浓度成正比关系，通常浓度范围为5~25mmol/l。

　　样品溶解在流动相中可以避免在反相色谱过程中发生缓冲能力的问题，尤其是流动相缓冲液浓度较低或注入样品量较大的时候尤为重要。

　　当缓冲容量偏低时，可以从以下方面调节缓冲容量：

　　1、减少缓冲液pKa与流动相pH之间的差异(可调节pH或更换缓冲液)

　　2、矿大流动相pH和溶质pKa之间的差异(当差异足够大时，溶质倍完全离子化或者保持非离子化形式此时缓冲液显的不重要了)

　　3、增加缓冲液浓度

　　4、减少样品进样体积

　　5、调节样品的pH与流动相的一致。

四、流动相pH值对色谱分析的影响

      一般来说pH对于中性化合物几乎没有什么影响。这是因为一般情况下中性化合物不具备解离能力，因而不会对谱图的分离选择性及峰形的对称性产生影响。对于含有极性官能团的化合物来说，pH会影响化合物的存在状态。进而影响分离选择性及色谱峰的对称性。除此之外，一些做了改性或者Mixed-Mode类型的色谱柱，即便分析物中不含有可电离的物质，但是pH值会影响色谱柱上的官能团状态，进而也会影响到中性化合物的分析。因此在进行方法开发之前，首先要对所选的色谱柱及本身样品所含成份的定性认知。

      下图展示的是不同pH对于中性非极性化合物、极性不可解离化合物以及极性可解离化合物的分离选择性的影响。

      查阅文献可以看出，当水溶液的pH偏离化合物本身pKa 2个单位以上时，化合物主要以一种形态存在，而当pH在化合物本身pKa 2个范围以内时，化合物以两种形态存在(不解离与解离形态)，而当溶液的pH等于化合物本身的pKa的时候，化合物解离形态与不解离形态大约各占50%，如下图所示。

       极性可解离化合物的容量因子与pH之间呈现S型曲线。对于碱性化合物而言，pH越大，其容量因子也越大；对于酸性化合物而言，pH越小，其容量因子也越大，这也是在使用反相HPLC“酸加酸，碱加碱”的原因，其目的在于抑制酸碱极性化合物的离子化作用，增强与C18固定相之间的相互作用，而提高该类化合物的保留时间。同时需要注意的是：在进行方法开发的时候，尽量选取酸的高保留平台去和碱的高保留平台区，如果在中间斜率比较大区域，在pH值稍微有些变化的时候就会对峰形、保留时间、分离度有很大影响。

       pH的大小影响到极性可解离化合物以及色谱柱硅羟基的解离程度，离子化的分析物在典型的ODS反相色谱柱上往往会出现拖尾现象。通过改变流动相的pH，抑制其解离，可改变极性可解离化合物的容量因子，改变其出峰位置，提高分离的选择性，且提高色谱峰的对称性。此外，有机相的添加会使得流动相的pH以及待分析化合物的pKa发生改变，因此在调节流动相pH的时候，最好将此部分也考虑进去，在色谱柱的耐受范围内，尽可能地调节pH远离化合。