摘  要 / Abstract

本文对脱氧核糖核酸(DNA)分子鉴定技术的概念与内涵，及其目前在中药标准的应用情况作了较为详细的介绍；提出目前存在的主要问题是标准少、标准方法的执行力度弱，以及缺少分子生物学技术专门人才。本文认为解决这些问题的根本措施在于加强DNA分子鉴定技术相关人才队伍建设。

This article introduces the concept and content of deoxyribonucleic acid (DNA) molecular techniques and their application in the authentication of traditional Chinese medicine (TCM).The authors point out that the main problems with DNA molecular techniques are the lack of standard methods and insufficient implementation of those standards,and more fundamentally the lack of qualified technician.Therefore,strengthening the training and cultivation of technicians skilled in DNA molecular techniques is the key to solving these problems.

关 键 词 / Key words  中药; 鉴定; DNA 分子鉴定技术; 中药标准

traditional Chinese medicine; identification; DNA molecular techniques; standards for traditional Chinese medicine

01、前    言

自2010年版一部《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)首次收录蕲蛇和乌梢蛇两个品种的聚合酶链式反应(PCR)鉴别法，至今DNA分子鉴定技术在中药标准中的应用已有十多年历史[1-2]。最新的《中国药典》2020年版一部中共收录了动物药3个品种、植物药2个品种的DNA分子鉴定技术相关方法，以及中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则[3-5]。十年来该技术的应用在曲折中前进：至今多数药检系统人员对这一技术仍然不熟悉或缺乏正确认识，相关的检验业务尚未开展，缺少独立的分子生物学实验室。在标准研究和标准执行两个层面，都存在明显的“躲避”和“疲软”状态。如何加快推进DNA分子鉴定技术在中药检定中的应用，是值得我们思考的问题。

02、DNA 分子鉴定技术介绍

脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是生命体的遗传物质，是生物的设计蓝图，据此构建细胞内的分子，指导下游核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和蛋白质的合成。以蛋白质为核心的生物合成工厂，每时每刻都在合成着生命功能所需的各种物质，这种合成随着时间、空间(生命体的不同部位)、环境等因素的变化而变化。DNA作为生命活动的总司令，对同一生命体而言，不会随着外在因素的变化而变化，是比较固化的物种特征，其差异主要存在于不同的物种之间。因此，可以根据DNA序列的差异，进行物种鉴定或鉴别；与之相关的技术，即DNA分子鉴定技术。

中药DNA分子鉴定，即常说的中药分子鉴定，黄璐琦院士团队将其列为分子生药学的一个分支学科[1]。从广义上来讲，中药分子鉴定与DNA分子鉴定并不等同。因为“分子”可以是DNA，也可以是蛋白质或小分子化合物。所以所谓分子鉴定，既可以指DNA水平的鉴定，又可以包括蛋白质水平或小分子化合物水平的鉴定。但是从名词使用习惯来看，中药分子鉴定一般指代的就是DNA分子鉴定。而PCR作为非常重要的分子生物学技术手段，也常常被用来指代DNA分子鉴定技术。然而需要明确的是，中药分子鉴定、DNA分子鉴定以及PCR三者的含义严格来讲是不同的(图1)。

DNA作为遗传信息的直接载体，具有信息量大、遗传稳定性高、化学稳定性强等特点。PCR发展至今已经是很成熟的技术，操作简便快捷，应用也颇为广泛，几乎渗透到生命科学领域的各个方面。例如在新冠病毒核酸检测中，应用PCR相关技术可以在短时间内完成对大量样本的快速筛查；由于不需要昂贵的大型检测仪器及检测成本低廉，第三方检测机构和地区医院也纷纷建立检测实验室，为疫情防控做出了重要贡献。在中药鉴定领域，DNA分子鉴定技术在易混淆品种、濒危珍贵动植物药材、破碎药材、陈旧药材、考古出土中药珍贵样品的鉴定、药材掺伪鉴定、含中药原形的中成药鉴定(丸剂、散剂等)等方面具有十分突出的技术优势，解决了传统鉴别中的诸多难点问题，展示了良好的应用前景[6-9]。

目前中药鉴别检验中比较常用的是薄层色谱法，与之相比较，DNA分子鉴定法的优势在于：直接将物种区别的本源——遗传物质作为检测靶标，因而专属性更强；对于不同药材品种的检测，反应中所需的缓冲液具有通用性，并且高度商品化，使用方便；方法的反应条件相对固定，一般不需要自行调整，易于标准化操作；不会受外界环境如温湿度的干扰，检测结果更加稳定；所用毒性试剂少，环境友好等[10-13]。然而《中国药典》收录的近千个中药材品种中，只有寥寥几个品种项下收录了DNA分子鉴定方法；由此可见该技术在中药检验中的普及应用是远远不够的[3-4]。

按照基本原理不同，目前常用的中药DNA分子鉴定技术可分为位点特异性PCR技术和DNA测序技术。

位点特异性PCR技术，是指使用具有种属特异性的引物进行PCR扩增，只有目的物种可检测到扩增产物。根据检测手段的不同，该技术又可分为传统的PCR技术和荧光定量PCR技术。前者通过琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物的存在与否，只可以进行定性判断；后者通过荧光信号来反应PCR产物的有无和多少，既可定性又能定量[14-16]。

DNA测序技术是指借助于测序仪器对DNA序列进行解读。该方法的优势在于可以获得特定DNA片段的真实序列信息，进而通过DNA序列的比较分析得出物种鉴定或种属鉴别结论。目前测序技术已经非常成熟，测序结果直观确切，信息量大，在中药检验和标准研究中不可或缺，应大力推广[5,8]。

根据测序通量的不同，可分为一代Sanger测序和高通量测序。前者测序周期短，成本低，准确性高，应用更为普遍；后者对于测序样本的质量要求较高，测序前需要先建库，周期长，成本较高，主要可用于标准研究前期鉴别标记的寻找，一般不宜直接作为检测方法应用。

03、DNA 分子鉴定技术在中药标准中的应用情况

目前，《中国药典》2020年版一部收录的相关标准方法有动物药蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇饮片【鉴别】项下PCR法，植物药川贝母、霍山石斛【鉴别】项下聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法(表1)。在《中国药典》四部通则中，收录了《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》[3-4]。此外，九味羌活丸等几个中成药品种的水稻源性成份检查法近日也纳入了国家药品监督管理局补充检验方法。

三种蛇类药材都是采用PCR鉴别方法，即通过将正品与常见伪品的DNA序列比对，设计正品特异性扩增引物。结果中正品应有单一扩增条带，伪品则应无扩增条带出现。该类方法在《中国药典》中的出现，改变了以往仅靠性状特征进行鉴别的状况。事实上，有些不同种类的蛇看起来比较相似，而加工成小段的饮片就更增加了性状鉴别的难度。比如，乌梢蛇的颜色和形态与灰鼠蛇很相近，没有一定的经验很难分辨；通过PCR方法，只需按照规定步骤操作，乌梢蛇可以出现单一的阳性条带，而灰鼠蛇对应位置没有条带，从而非常明确的区分二者。

川贝母PCR-RFLP鉴别法是首个被《中国药典》收录的植物药DNA分子鉴定方法[3-4,17-18]。川贝母是多基原药材，来源于6种同属的百合科草本植物的鳞茎，分别是川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母。按照性状不同，又可分为松贝、青贝、炉贝和栽培品。由于川贝母药材本身性状变异就很大，同属植物的鳞茎在外观上与川贝母的有些种类又很相像，所以一直以来靠性状鉴别判定是否川贝母正品非常困难。川贝母与其他贝母在市场价格上相差悬殊，因此伪品冒充的现象也屡见不鲜，如小平贝冒充松贝，伊犁贝母冒充太白贝母，新疆贝母冒充青贝等。《中国药典》自2010年版第一增补本起，收录了川贝母PCR-RFLP鉴别法。该方法是基于川贝母ITS1区域存在一个独特的限制性内切酶位点SmaⅠ，可以将扩增片段切割，从而在琼脂糖凝胶电泳图上形成两条位于100～250bp之间的条带；常见伪品不能被SmaⅠ切割，所以在结果图上只有1条条带。如此检测人员只需按照标准操作流程和规范，就能将川贝母正品与伪品客观的区分开来。这一国家标准的颁布，使得多基原药材川贝母的鉴别检验水平有了质的飞跃，对川贝母药材市场的影响也颇为突出。从持续进行的川贝母委托检验和抽验工作中可以看出，近几年的检验不合格率显著降低，表明川贝母伪品泛滥的状况得到了有效控制。

霍山石斛是《中国药典》2020年版一部新收录的品种，其鉴别项下也包括了PCR-RFLP鉴别法。与川贝母PCR-RFLP鉴别法不同的是，只有当PCR产物条带不能被切割时，即琼脂糖凝胶电泳图上为单一条带，才能判定为正品霍山石斛[3]。

此外，随着DNA条形码分子鉴定技术在中药鉴定中的应用研究越来越成熟，《中国药典》自2010年版第三增补本起收录了《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》(以下称《指导原则》)。《指导原则》通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。DNA条形码鉴定法的出现，使得中药材的鉴定结果更加明确，不仅可以鉴定真伪，对很多药材品种还能鉴定基原。由于扩增和测序采用的是通用引物，不必对每一种药材进行专门的引物设计，方法具有一定的通用性。另外，该鉴定法的有效应用取决于数据准确、可及的DNA序列信息数据库，或者经过准确基原鉴定的样本。目前可供公众使用的数据库主要有美国国立卫生研究院(NIH)管理下的NCBI核酸数据库，该库包罗了多种生物的基因信息，比较庞杂；面向公众开放，可自由上传或者下载序列信息，因此其中不可避免会存在错误的信息。由陈士林教授团队建设的中药材DNA条形码鉴定系统，是目前相对比较全面的专门针对中药材的DNA信息数据库，但尚未对外公开使用。法定检验需要的是一个数据准确、来源可追溯，兼具查询比对、结果合理输出等功能的DNA标准序列信息数据库。在标准数据库尚不具备的情况下，运用DNA条形码技术进行中药鉴定时，可以采取数据库查询比对与标准药材样本DNA序列比对相结合的方式，从而最大程度保证鉴定结果的正确性。

尽管现阶段荧光定量PCR方法在中药检测中的实际应用还不是很普遍，但是随着中药质量控制技术方法的不断进步，未来应该有广阔的发展空间[20-22]。荧光定量PCR法可分为探针法和染料法，其中探针法的特异性、灵敏度和重复性都明显优于染料法，且能够应用于多种药材混杂的情况，在中药材和饮片掺伪检测中有很好的应用前景[21]。此外对于DNA含量较少(如牛黄类药材)或者由于深度加工处理导致DNA片段化严重的药材(如胶类药材)、配方颗粒和成方制剂等，都可以尝试建立基于荧光定量PCR探针技术的检测方法[11,22]。如拟定的补充检验方法“培植牛黄中猪源性成份检查方法”，基于特异性的猪探针引物，采用TaqMan探针技术对培植牛黄中可能的掺伪成份——猪源性成份进行定性检测，具有专属性强，灵敏度高，重复性好的特点。荧光定量PCR方法具有定性和定量的双重作用，可以有效解决目前存在较为普遍的中药材和饮片掺伪问题，具有良好的应用前景。

04、存在的主要问题及解决策略

生物技术是生命科学各个领域都必不可少的技术，在中药质量控制中同样不可或缺[23-25]。然而由于中药DNA分子鉴定方法在法定检验中的应用研究起步较晚，目前的应用还不是很广泛，并且多数《中国药典》药材与饮片品种项下尚无相关方法。另一方面，由于对该技术的了解和掌握不足，导致已有的标准方法在实际应用中的执行力度不够。例如，于2017年面向全国检验机构开展了川贝母PCR-RFLP鉴别法能力验证活动，最后只有50多家单位参加，而且通过率不足60%；这与其他检验方法的能力验证相比，无论参加单位数量还是通过率方面，都是比较低的。川贝母PCR-RFLP鉴别法从《中国药典》2010年版第三增补本就开始收录，然而到了2017年多数检验机构仍然对这一方法不够熟悉。由此可见，如何推广普及现有的标准方法以及建立更多的相关标准，充分发挥技术优势，从而更好地服务于中药质量控制，是迫在眉睫的问题。

面对上述问题，建议：首先，应重视和加强标准建设，加快推进中药DNA分子鉴定方法相关的标准研究，同时注重标准研究的规范性，从而建立更多行之有效的中药分子鉴定标准方法。这其中，应尤其重视法定DNA条形码信息数据库建设及相关鉴定软件的开发，使得通用高效的DNA条形码鉴定技术真正服务于中药日常检定工作[26-27]。

其次，应加强专业人才队伍建设。生物分析是一门专业技术性较强的独立学科，其方法和思维方式等均不同于理化分析领域[28]。以往由于大多数院校的中药分析专业在课程设置上缺少分子生物学理论和技术的实践课程，在校时未能系统学习相关专业知识，因此目前大多数中药分析从业人员对于该领域是比较陌生的。一般涉及该技术的检验或标准研究工作并不是中药科室在承担，而是对这一技术更为熟悉的中药以外的其他科室，如从事微生物或生物制品检验的部门科室；但是这些部门的工作人员对于中药本身并不熟悉，导致在检验或标准研究中势必会带来一些偏差[29]。因此，应对中药检验人员加强分子生物学技术的培训，并从事相关的工作。同时，中药检验部门应引入分子生物学相关专业的专门人才，才能真正将该技术涉及的检验和标准研究工作做好。

从长远来看，中医药的良好发展离不开生物技术的参与，后者源于西方医学的基础研究，也可以并且应该引入到中医药的研究中来。在未来，生物技术的参与程度会越来越多的影响到对于中医药的研究深度，包括中药质量控制的研究。因此，在中医药专业学生的课程设置上，应将分子生物学作为一门基础课程，进行系统、全面、深入的学习，让PCR技术成为中医药专业学生人人都会的基本技能，让生物技术分析的理念深入人心。唯有如此，才能从根本上优化中药检验人才的知识结构，适应时代发展的需要，从而推动中药质量控制水平迈向新台阶。