一、标准菌株的概念及其应用

 

1.1标准菌株概念

 

1）GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范食品微生物检测：

 

①标准培养物：标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的统称。

 

②标准菌株：至少定义至属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述，有明确的来源。

 

③标准储备菌株：标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。

 

④工作菌株：由标准储备转接后获得的同种菌株。

 

1.2标准菌株的应用：

 

各种国际标准、国家标准、行业标准及企业标准等的相关微生物检测，用于验收培养基(包括试剂盒)、验证方法和评估实验操作。

 

二、微生物菌种管理的相关流程

 

2.1菌株的采集：

 

实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。选择有资质的标准菌株的合格供应商，每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书，来证明所采购的标准菌株是合格的。

 

2.2标准菌株和验收

 

实验室收到标准菌株，首先应进行符合性感官检查，记录菌株号和标准菌株来源途径信息，确保溯源性清楚。同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。

 

2.3冻干标准菌株的复活

 

2.3.1开启产品包装：先用70%酒精棉擦拭外包装，从凹口处撕开产品外包装，撕掉标签上的拉片，将其贴于菌株接收、保存记录序号前面。

 

2.3.2复活：选择合适的培养基和培养条件（根据生产商说明或有关技术通则见 附录）进行复活。菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。冻干菌株的传代次数不得超过5代，从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。

 

捏管帽处安瓿瓶（仅一次）使其释放水合液体。垂直握住安瓿瓶并轻拍之，使液体流入含小球的管底。通过挤捏压碎小球使其与液体混合，立即将拭子浸于水合液体。挤压并旋转拭子，接种于初级培养平板，接种圈的直径约为25mm，用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20次，促使分离出单菌落。同时吸出部分菌液接种胰蛋白胨大豆肉汤管，副溶血性弧菌接种3%氯化钠菌胰蛋白胨大豆肉汤管。将接种好的平板和管立即进行培养。细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出，但是少数菌会表现出延滞期延长的现象，需要将正常培养时间加倍。复活后的菌株为F1代。

 

附录：

 

 

2.3.3将TSB生长的浓菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混匀后将液体吸出，将保藏管-18℃保存1-3年为标准储备菌株F2代。将平板上生长的良好菌株接种于营养琼脂斜面（副溶血性弧菌用3%氯化钠营养琼脂）36℃培养24h当作工作菌株，记录为F3代。

 

2.4工作菌株确认方法及依据

 

用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板（营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂）上或相应的细菌鉴别平板（如伊红美蓝、麦康凯、BP等上划线分离单个菌落，置适宜条件下培养（若该类微生物为厌氧菌，则培养条件应为厌氧条件）。以同样方法取真菌和酵母菌至SDA（萨布罗培养基）平板上或玫瑰红钠培养基平板上，23～28℃下培养7d；培养后观察是否具有典型的菌落状态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态以确定菌种。

 

2.5 污染处理

 

假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯。要将该污染培养物做灭菌处理，寻找原因，重新分离挑选纯菌落。

 

2.6菌种保存

 

所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法）；

 

具体菌种保存方法一般为：

 

将复苏后肉汤与灭菌甘油按15%甘油比例（肉汤8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃冻存，（可用2mL冻存管冻存多管），作为保藏储备菌株F1代，也可使用商品化的菌种保存管（青岛海博的瓷株菌株保存管）。

 

2.7菌种的传代

 

2.7.1标准菌株的复苏：① 菌种操作应在无菌条件下进行，防止杂菌污染。

 

② 每次使用和复苏时只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。

 

2.7.2标准储备菌株每转接一次须进行确认。（确认方法一般为他们各自独有的形态，在鉴别培养基上的形态）

 

2.7.3工作菌株转接的方法：①、配制营养琼脂培养基（溶血性弧菌加3%氯化钠 ），121℃高压灭菌15分钟后分装在试管内，冷却后备用。

 

②、在无菌条件下，用接种环挑取菌苔至新鲜试管上作“米”字形划线接种，放置在36℃的培养箱内培养24小时。

 

2.7.4工作菌株的使用

 

2.7.4.1内部质量控制：一个月一次阳性对照、培养基每批验收；

 

2.7.4.2外部质量控制：能力验证、实验室比对；

 

2.7.5工作菌株的期间核查

 

2.7.5.1期间核查的频率：每半年对使用标准菌株进行一次期间核查。

 

2.7.5.2工作菌株期间核查的方法及依据：同工作菌株的确认一样。

 

2.7.5.3建立标准菌株期间核查记录。

 

2.8菌种的标识和使用期限：

 

2.8.1标识：菌种代数的计算为干粉菌种为第0代，转接一次加一代。具体标识为：例单增李斯特氏菌第0代，标识为DZ-0，第一代标识为DZ-01第一代有12支，则DZ-01-01、……、DZ-01-12；并标明日期：如2016.02.13这样填写。

 

2.9 菌种的保藏

 

2.9.1将试管内菌种放入冰箱中2～8℃冷藏保存。

 

2.9.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中2～8℃保存。每支保存菌种需标明菌名、标准编号、传次、传代日期。

 

2.10菌种的销毁

 

2.10.1菌种使用后或超过贮存期的应进行销毁。

 

2.10.2需销毁的菌种，应用高压蒸汽（121℃）灭菌30分钟。

 

2.10.3灭菌后，再进行清洗和处理。

 

2.10.4销毁的菌种应做好记录。销毁时由化验负责人监督销毁，保管人员负责销毁。

 

三、实验室常用菌株保存方法

 

1.斜面低温保存法

 

将分纯的待存菌接种于适宜的固体斜面培养基上，得到充分生长后，用封口膜封口，贴上标签，保存于4℃的冰箱中。此法操作简单、使用方便、不需要特殊设备，是实验室菌种保存最常用的方法。但保存时间短，一般每个月都要移种1次，而且菌种容易变异，所以此方法只适合实验室短期实验菌株的保存。

 

2.半固体琼脂法 

 

用接种针将以分纯的待存菌，穿刺接种于半固体中，放入培养箱培养后出，封上无菌的液体石蜡，贴上标签，放4℃冰箱保存。此方法简便易操作，不需特殊设备、技术难度不大，但保存的时间不长，一般只能保存1年以内，而且对抵抗力弱以及一些特殊菌种大概只能存活3～6个月，需要频繁的传代，这样很容易使菌株受到污染、变异。所以此方法不适用菌种的长期保存，只适合实验室一些要求不高的菌种的短期保存。

 

3.液体石蜡保存法 

 

将液体石蜡灭菌，放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面1cm为准，将试管直立，贴上标签，置4℃下保存。此法制作简单，不需要特殊设备，菌种可以保存1年左右不需要经常移种，缺点是保存的时候需要直立放置。此方法适合实验室短期保存，而且保存时需要一定的空间。

 

4.高层半固体琼脂石蜡保存法

 

将待存菌经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高固体琼脂培养基中，经培养箱培养后取出，用灭菌过的液体石蜡滴加到半固体琼菌种管表层约0.5cm高度，贴上标签，存放4℃冰箱。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌株1～2年。所以适合实验室菌株的较长期的保存。

 

5.纸片法 

 

将已分纯的待存菌用无菌镊子镊取纸片，在纸片上刮取4～5个菌落，入冻存管内，盖上盖子后用封口胶布封住边缘，贴上标签，放入冰箱冷冻保存(－20℃左右)。此方法具有操作简单、不需特殊设备、经济实用、保存空间小等而且保存时间至少2年，但对一些营养要求比较高的菌种，存活率不理想。所以方法适合实验室一些营养要求不高的菌种较长时间的保存。

 

6.甘油液保存法

 

将已分纯的待存菌接种于肉汤中，37℃培养18～24h，然后按5份肉汤溶液、2份甘油－生理盐水保存液的比例分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中，贴上标签，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌种3年左右，无变异现象，而且此方法还可以保存一些要求较高的特殊菌种，适用范围广。所以此方法适合实验室普通菌种或特殊菌种的较长期的保存。