背景：

1.HPLC对杂质限度较低的方法开发思路主要是提高与浓度相关参数（杂质响应一前提下）：如杂质的浓度、进样体积等，但当改变这些条件无法达到要求时只能寻求其他高灵敏(MS)的检测器,但是开发一个质谱的方法比较有难度，且不容易普及。

2．峰高和峰面积是HPLC中最为常见的两个重要参数：峰高越高，代表着化合物有更好的信噪比；峰面积越大，在进行定量限重复性研究时会越简单。

3.超高效液相色谱的原理主要是针对谱带的展宽进行了优化：柱外管路进行改进（0.1mm内径）；色谱柱进行改进（多数将内径改为2.1mm，1.9um小颗粒）。

4.目前HPLC主要使用的色谱柱内径是4.6mm，如4.6*150mm；4.6*250mm规格等类型，相比较UPLC化合物峰的展宽会比较大，但是如果UPLC色谱柱在普通液相使用，一般仪器的压力又无法耐受。

图1

过程：

1.第一板斧：采用中间内径（3mm）色谱柱，提高杂质峰高，缩短运行时间

问题：方法开发时，使用YMC Triart C18（4.6×50mm，5μm）色谱柱，流速0.8ml/min,流动相 0.1%磷酸溶液-[四氢呋喃：乙腈（1:2）]（10:90），发现杂质的响应较低，灵敏度不够，见图1-A；

解决方法：根据UPLC提高柱效的理论，我们采用了内径小一个规格的色谱柱YMC Triart C18（3.0×100mm，3μm），其他条件不变；测定见图1-B。

结果：杂质峰高提高了近一倍，而且缩短了保留时间，提高了分析效率。

2.第二板斧：降低流速提高杂质的峰面积

问题：经摸索发现更换高效的色谱柱后只提高杂质峰高，峰面积的响应没有变化（因杂质峰面积较小时重复性不好，定量限不好做）；同时该色谱柱内径较小，导致柱压过高，有超压风险。

解决方法：根据紫外检测器（浓度型检测器）峰面积与流速的乘积为一常数这一理论，将流速降为0.6ml/min。

结果：杂质峰面积得到提高，满足了定量需求；同时也将降低了柱压，进一步提升了小内径色谱柱在普通液相中的应用。

3.第三板斧：提高有机相比例，调整保留时间，进一步提高峰高。

问题：流速降低虽提高峰面积，但导致杂质保留时间延后。

解决方法：提高有机相比例为92%。

结果：经调整流速和有机相比例后色谱图见图1-C，杂质保留时间在和图1-B一致的情况下，峰高和峰面积都得到了提高；同时也将降低了柱压。

结论：

采用更换3.0mm内径色谱柱+降低流速+提高有机相比例三板斧思路将杂质的峰高可以提高1-2倍，峰面积也得到增大（根据流速调整大小而改变），同时将分析时间缩短。

该思路在杂质方法开发时运用较为简单，只有三板斧，试下就知道效果怎么样，可以应用在液体制剂的迁移物方法开发、化合物的限度较低的方法开发，对于清洁验证方法开发也比较实用。