在植物检测中，虾青素属于常见的植物色素种类之一。由于拥有比β-胡萝卜的素更强的抗氧化能力，所以虾青素常用于保健品、食品添加剂、饲料添加剂、医药、化妆品等产品生产。商业化生产的虾青素分为人工化学合成和天然生物合成两大类。目前商业化的虾青素主要来源于藻类和微生物、甲壳动物的壳，提取方式通过真菌发酵或粉碎提取，比如含量较高的雨生红球藻和红法夫酵母应用就比较广泛。

一、需求背景

苏州某生物科技公司，想要检测的一款虾青素产品，尤其是光异构体的含量。由于今年来雨生红球藻行业催生的虾青素市场得到广泛发展，所以市场上相关产品良莠不齐、以次充好现象也是客观存在的。用人工合成虾青素或者红法夫酵母酵母虾青素冒充雨生红球藻虾青素销售使用的原料，一旦被应用到实际产品中，结果都可能是灾难性的。虾青素含量测定已经不能满足当前的技术要求，对其结构进行定性定量也成为检测的重要一环。

虾青素基本的化学结构是由四个异戊二烯单位以共轭双键形式相连接，两边是两个含氧的六元环，且羟基处于羰基的α位，构成了α羟基酮的结构。由于虾青素有2个手性中心，在3-和3’-位，因此有三种旋光异构体，分别是3S,3’S（左旋）；3R,3’S（内消旋）和3R,3’R（右旋）。而如果是合成虾青素，则由3S,3’S（左旋）；3R,3’S（内消旋）和3R,3’R（右旋）三种旋光异构体按接近1:2:1的比率组成，一直以来作为红色着色剂应用于动物着色。天然来源的虾青素则不同物种存在不同旋光异构体组成和比例，其中红法夫酵母发酵虾青素为3R,3’R（右旋）结构，，雨生红球藻作为3S,3’S（左旋）结构。因此我们可以通过检测虾青素的旋光异构体含量进行定性定量分析。

二、检测方法确定

虾青素的检测方法主要有分光光度法和高效液相法。分光光度法主要是利用虾青素的最高吸收峰为478，因此在波长为 478下进行比色即可测定虾青素的含量。由于该种方法比较简单，可能存在的误差也较大，所以高效液相色谱法是检测虾青素的主流方法。比如，GB/T 31520-2015就规定了用液相色谱法检测红球藻中虾青素。虽然GB/T 31520-2015规定了虾青素含量的检测方法，但是虾青素的光异构体含量却没有提出，所以国家标准GB/T 38478-2021专门针对光异构体含量检测给出了一套解决方案。所以我们决定已经GB/T 38478-2021采用液相色谱法进行测试。

三、试验步骤

1.样品制备

虾青素样品的提取方法要根据具体类型进行选择，比如固体类、油剂类和水溶液类试样的提取方法都是不一样的。

该生物科技公司的样品为固体试样，所以我们对样品进行如下制备：称取50.0mg~100.0mg置于干燥的20mL玻璃匀浆器中，加入2mL丙酮，充分研磨使样品破碎完全，转移至10mL离心管中，用5mL丙酮溶液分三次清洗玻璃匀浆器，合并提取液，5℃下3800r/min离心5分钟，将上清液转移至50mL容量瓶中，离心管管中加入2mL丙酮溶液。重复上述步骤3次以上，直至提取后的渣呈灰白色，合并上清液，用丙酮溶液定容至50mL，供测。

注：虾青素含量高于2%的试样的称样量不大于50mg。

2.测试溶液制备

移取2.0mL皂化后的溶液至10mL玻璃离心管中，往管中加入1g的十水硫酸钠，2mL石油醚后剧烈震荡30次或涡旋混合30秒后，然后避光冰水浴中静置或置于离心机中3000rmp下离心3min，溶液出现明显分层，色素被转移至上层石油醚中，用移液管小心地将石油醚层转移至新的10mL玻璃离心管中，氮气吹干石油醚，加入1.0mL乙腈超声溶解，得到的溶液即为供试品溶液。

3.色谱条件

色谱柱：IC 多糖衍生物共价键合手性柱， 4.6 mm×250 mm， 5µm， 或相当者。

柱温：25℃。

紫外检测器：检测波长 470 nm。

进样量：20 µL。

流速：1.0 mL/min。

流动相:甲基叔丁基醚+乙腈=35+65。

3.定性定量

旋光异构体组成成分是虾青素制品重要的指标， 该指标主要考核不同来源的含虾青素产品。由于虾青素拥有左旋， 内消旋和右旋三种不同的旋光异构体， 其中雨生红球藻来源的全部是左旋结构， 红法夫酵母来源的是右旋结构， 而人工合成的虾青素为三种旋光异构体的混合物（其左旋：内消旋：右旋为 1:2:1） ， 而不同旋光异构体的生物活性和安全性不尽相同， 需要对产品中的虾青素旋光异构体组成成分进行鉴定。检测方法就是，分别注入 20 µL 适当浓度的左旋虾青素的对照品溶液， 人工合成虾青素对照品溶液， 右旋虾青素的对照品溶液， 供试品溶液， 按下图中列出的色谱条件进行液相色谱分析测定， 根据对照品溶液色谱中的虾青素同分异构体的保留时间定性对照品色谱图

考虑到操作的简便性和经济性， 虾青素旋光异构体的定量计算， 首先使用由国标 GB/T31520-2015 法测得的虾青素总量， 再与其中具体的某种虾青素旋光异构体所占比例相乘， 所获得的乘积作为最后的某种虾青素旋光异构体的含量。

四、总结

我们通过对虾青素旋光异构体进行测定，可以准确判断虾青素产品的来源，从而为虾青素生产企业提供产品质量控制和质量监督的重要参考数据。当然，对于选光异构体定性定量也可以帮助我们寻找高效合适的物理和化学胁迫因子，在不对藻细胞致死或将致死量控制在一定范围内的前提下，胁迫藻细胞尽量产生更多的虾青素；如果是红法夫酵母，我们可以通过研究其培养基的成分来存进虾青素的合成。