我国体外诊断产业正处于蓬勃发展的阶段，积累了一定的技术基础，但尚存在产品设计开发过程不规范等问题。如何在符合我国国情的前提下，指导企业科学合理的开展体外诊断试剂的设计和开发成为亟待解决的问题。这就要求企业不仅应重视临床性能的评价，也需系统而全面地进行分析性能的研究，以综合评价产品的安全有效性;其中关键的项目之一为定性检测试剂的阳性判断值或定量检测试剂的参考区间。正确的建立体外诊断试剂的阳性判断值或参考区间会大幅提高临床评价指标满足验收标准的概率，反之可能对临床试验结果（如灵敏度和特异性）造成不利影响。

1、阳性判断值或参考区间确定的总体要求

体外诊断试剂的阳性判断值或参考区间研究是临床前研究的重要组成部分之一。生产企业应当在主要原材料和生产工艺经过选择和确认、质量管理体系得到有效控制并且保证产品质量稳定的基础上，制订方案并相应的开展研究。试验人员应经过必要的培训，熟悉检测系统的操作程序、样本制备方式和试验方案，严格执行校准和质量控制方法,定期对设备进行维护和保养。建议使用多批产品，采用科学合理的试验方法确定产品的阳性判断值或参考区间。在对结果进行数据检查后，选择适当的统计方法进行检验或分析，并形成报告。样本数量需符合统计学要求。

2、阳性判断值或参考区间确定的方案和采用的样本

2.1阳性判断值或参考区间的特点

阳性判断值或参考区间反映了体外诊断试剂区分受试者目标状态特征（如健康或疾病）的性能,在鉴别良性与恶性疾病、确定疾病进程、监测治疗效果、判定预后情况、指导临床处置或者影响医疗决策制定等方面具有重要意义。阳性判断值或参考区间的正确制定能够充分体现产品的临床表现，如区分正常/异常的能力或诊断准确性。

2.2阳性判断值或参考区间确定的方案和采用的样本

阳性判断值或参考区间的确定过程包括建立与确认两个阶段。建议区分训练集和验证集，分別纳入不同的样本子集进行研究。必要时应考虑充分覆盖不同亚群的样本。注意纳入研究的样本应来源于产品的适用人群以及相关适应症。注意应采用临床真实样本进行研究，明确样本的来源、类型和背景信息（如年龄、性别、干扰因素等）；如检测结果有明确的疾病指向，还应包括临床诊断信息。应从预期适用人群中选择具有代表性的目标人群（如不同组织病理类型或分期的肿瘤、其他相关的良恶性疾病），并从临床意义的角度考虑其中可能存在的亚群,对各个亚群检测值的差值进行统计学检验，如存在显著差异，则应针对亚群分别建立参考区间（如不同种族、性别、年龄、目标状态）。必要时对不同亚群（如不同分期的肺癌患者）样本分层进行统计分析以确定各个亚群的阳性判断值或参考区间。可具体比较不同临床背景特征的适用人群，不同种族或地域人群,具有流行病学差异的人群以及不具有可比性的样本类型之间的差异,必要时分别建立阳性判断值或参考区间。

另外，建议充分考虑建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群的代表性，在临床试验阶段进一步确认阳性判断值的准确性。对于定量检测试剂，如为具有相同的地理区域以及人口统计学特征（包括种族）的目标人群，在方法学比较研究结果一致的前提下，可考虑转移同类产品的参考区间。

3、阳性判断值或参考区间确定推荐的研究方法

3.1定性检测试剂

方法使用具有统计学意义数量的受试者样本，采用受试者工作特征曲线（ROC)的方法确定阳性判断值。样本来源应为该检测项目结果应用的代表性人群，并参照临床诊断信息或者对比方法的检测结果进行阴阳性判定。建议纳入阴阳性比例相似的样本进行研究,无需选取反映实际发病率的样本。在实际应用中，还需考虑检测结果与临床进程相关性的研究,不仅是与诊断结果一致性的研究。另外，建议申请人从临床意义的角度出发，合理设定灰区范围并详细说明确定的依据。注意明确对于灰区结果的后续处理措施，如进行复测后确认或者其他试剂确认等。

3.2定量检测试剂

可根据数据的分布形式，采用非参数统计法或者参数统计法。方法可使用至少120个来自目标人群的受试者样本，采用非参数统计方法建立参考区间（如适用，包括90%或95%置信区间）。建议基于严格的人群人选标准，排除检测项目潜在异常的人群，入选健康正常人样本建立参考区间。可使用调查问卷评估各受试者的健康状况。在实验室、分析系统（方法和仪器）、地理区域或人群存在一个变量的情况下，可考虑转移分析物的参考区间。转移参考区间的方法可使用至少20个受试者样本进行评价，并在多于2个样本超出参考区间范围的情况下纳入更多的样本进行验证。如无法转移，建议建立参考区间。

4、不同方法学产品的举例说明

4.1采用酶联免疫分析技术的检测试剂

(1)确定临界值中的n数值以及阴性样品A值的标准差（临界值=阴性样品平均A值+nx标准偏差）；

（2)使用临床样本验证临界值，包括阴性样本和阳性样本。推荐采用ROC曲线法,纳入一定数量的弱阳性样本进行验证。

4.2基于实时荧光PCR等方法的沙眼衣原体和/或淋病奈瑟菌核酸检测试剂

对于荧光实时PCR方法即为用于结果判读的Ct值的确定，包括确定基线阈值（threshold)和阈值循环数（Ct)的研究等。样本来源于各种可能接受沙眼衣原体和/或淋病奈瑟菌感染检查的人群，包括尿道拭子、宫颈拭子或阴道拭子、尿液或其他泌尿生殖道样本。建议样本总数不少于100例，注意纳入一定数量的弱阳性样本进行研究。如采用稀释方式获得低浓度样本,应同时考虑基质效应的影响，建议采用临床阴性样本作为稀释基质。另外，建议充分考虑建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群的代表性有限（如不能充分覆盖泌尿生殖道样本中的干扰物质），进一步通过临床评价验证和确认阳性判断值的准确性。

4.3基于免疫化学发光等方法的人细小病毒B19IgM/IgG抗体检测试剂

申请人应考虑不同地理区域流行病学背景以及免疫缺陷人群、免疫抑制人群与正常人群之间的差异，选择具有代表性的样本建立阳性判断值。试验所用样本来源还应考虑到年龄（成人或儿童）、不同的感染阶段和晚期）的影响。建议样本总数不少于l〇()例，注意纳入一定数量的弱阳性样本进行研究。另外，建议充分考虑建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群的代表性有限（如不能充分覆盖血液中的干扰物质），进一步通过临床评价验证和确认阳性判断值的准确性。

4.4基于荧光原位杂交法的HER2基因扩增检测试剂

可参考最新版临床指南性文件建立阳性判断值，并采用具有统计学意义数量的样本对判读规则以及预设阳性判断值进行确认。应包含HER2扩增、HKR2无扩增以及一定数量阳性判断值附近的组织样本，包括HER2/CEP17荧光信号总数比值在2附近（1.8〜2.2),或者每个细胞的平均HER2拷贝数在4〜6附近的样本。首先设定检测结果重复性较好的目标，即HER2平均拷贝数或者HER2平均拷贝数/CEP17平均拷贝数的标准差/变异系数范围验收标准，确定初始统计细胞区域和数量，并在结果不确定时纳入更多区域或数量进行统计。然后建议参照组织病理学特征或者1HC结果确定可能存在扩增的浸润性乳腺癌/胃癌区域，选择细胞核大小一致、胞核边界完整、DAP染色均一、细胞核无重叠、荧光信号清晰的细胞，随机计数2个区域中的至少20个细胞，并对结果进行统计分析。

4.5基于免疫组织化学法的雌激素受体、孕激素受体抗体试剂

可参考最新的国际、国内诊疗指南等相关文献资料。并对产品的染色特点进行研究，包括阳性样本中不同类型细胞的着色颜色、染色部位及不同强度阳性组织的染色特点等。注意纳入充分覆盖不同染色强度、不同阳性细胞百分比及ER/PR阴性的乳腺癌样本进行包含染色位置，染色强度和阳性细胞百分比数的评价，并明确样本的背景信息。

4.6基于高通量测序法的胎儿染色体非整倍体（121、1'18、113)检测试剂

在大样本量以及数据符合正态分布的情况下，可采用Z-值（Z-sc〇re)算法确定孕妇外周血血浆中胎儿游离t)NA的数量，其中Z-值反应的是当前数值距离平均数的相对标准距离，Z-值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布。

4.7多个目标基因联合检测试剂

例如包含多个目标基因的肿瘤相关基因甲基化检测试剂，可分别确定不同单个目标基因和内参基因Ct值的差值或者拷贝数的比值，并对结果进行阴阳性判定。在此基础上，采用逻辑回归方程算法以及R0C曲线法，对Ct值进行回归分析拟合分析,具体为赋予各个自变量不同的加权系数并计算总体分值。再根据拟合值绘制R0C曲线，选择约登指数最大值点或者平衡临床性能最优的灵敏度和特异性界值，从而确定阳性判断值。如产品的临床适应症为肝癌，应至少纳入正常健康人、不同类型肝炎病毒感染引起的肝炎、肝纤维化、肝硬化、不同类型肝炎病毒感染引起的肝癌（包括不同分期）、其他类型原发性肝癌、转移性肝癌、其他类型消化道癌症（如胃癌、肠癌）、其他相关的良恶性疾病患者的样本建立阳性判断值。上述样本应分为训练集和验证集，分别包含数百例样本，以保证算法模型的可靠性。另外，建议进一步通过临床评价确认阳性判断值的准确性。

针对产品设计开发过程中存在的科学合理性不足的问题,必要的解决手段之一是指导企业如何规范并高效的开展临床前研究，从而提高临床试验成功的可能性。本文在对目前我国相关产品注册申报中存在的问题以及审评工作中存在的难点进行全面梳理的基础上，对体外诊断试剂阳性判断值或参考区间确定的要点进行了初步探讨。预计将帮助生产企业更加科学合理地建立申报产品的阳性判断值或参考区间，相应地大幅提高产品设计开发的效率以及临床试验成功的概率。期待与各方协作探索更加优化的产品评价路径和方法，共同努力提高相关产品的研发效率以及提升研究质量。