前言

色谱分离是建立HPLC方法的首要考虑因素，深刻理解实验色谱参数如何影响分离效果，可以很好的帮助我们建立分析方法，运用HPLC技术解决研发过程中遇到的分析问题。

反相色谱方法（RPC）开发的一个重要开始起点，是选择合适的色谱条件，为一个给定的样品提供一个可靠的分离结果。两个色谱峰的分离度通常采用它们的保留时间和峰宽计算得到：

Rs=2[tR(j)-tR(i)]/(Wi+Wj)，Wi和Wj代表色谱峰i和j的峰宽。

色谱峰保留因子与保留时间的关系：k=(tR-t0)/t0

色谱峰宽、理论塔板数、保留因子的关系：W=4N-0.5t0(1+k)

由上面公式，可以导出色谱峰间分离度与保留因子、选择因子和理论塔板数之间的简单关系：

图1：分离度公式

分离度可以划分为三项：a项（第一个峰的保留因子），b项（分离因子）和c项（柱效或塔板数）。从这个公式中可以看出两个色谱峰之间的分离度，与峰保留因子、选择因子和理论塔板数密切相关。

通过改变这三项中的任意一项的值，都可以改善峰之间的分离度，其中提高分离选择性（α），是最有力的方法。

图1是等度条件下的分离度公式，下图2是梯度条件的分离度公式。

图2：分离度公式（梯度）

当需要分离多个色谱峰时，对于分离程度最差的一对色谱峰来说，分离度的要求是R≥2.0。这一对色谱峰通常被称为关键色谱峰对。它们的分离度是方法优化关注的焦点。

方法建立和开发时，第一步关键是选择一根柱效足够、选择性较好的色谱柱，色谱柱固定相是影响选择性最大的因素；依次是改变溶剂的强度，使色谱峰保留因子k值落在合适的区域范围，优化选择性α，最后是调整柱子的柱效塔板数，得到最优的分离度和分析时间。

图3：色谱参数对分离度的影响

1．保留因子k的优化

样品的保留因子k可以通过样品的保留时间和方法的死时间计算得到，k=(tR-t0)/t0

死时间t0可以通过色谱柱柱长近似计算，t0=0.01L，L为色谱柱长度（单位mm）。当选定色谱柱后，t0是一个常数，因此k值的大小可以通过改变有机相的组成（B%）来控制。通常k值控制在1≤k≤10范围比较合适，如图3。

图3 相对分离度与k值的关系

k=10时，当其它影响因素不变时，k值的增加几乎不再改善分离度，只会延长样品的保留时间。当分析方法用于制剂分析时，k≥2时，目标峰可以很好的与一些没有保留的辅料干扰峰分离。

RPC 的保留会随着有机相比例%B的改变而变化，表达为：logk=logkw-SФ

Ф是B溶剂的体积（为0.01*%B）,kw是当Ф为0时的保留因子，S为常数，对于分子量100-500Da的化合物来讲，S≈4。因此Ф每增加0.1个单位（+10%B），k值相应的减少到原来的1/10，或下降2.5倍。反之，Ф每减少0.1个单位（-10%B），k值相应的增加2.5倍。

如例1：80%的流动相B作为初始条件，0.3≤k≤0.8。当流动相B为70%时，峰1的k=2.5*0.3≈0.8,最后一个峰为0.8*2.5=2;依次降低有机相B的比例，找到合适的k值，如c, 1.8≤k≤6.6。

上述计算中的“2.5倍法测”只是一个粗略的方法，能够给出一个近似值参考。

例1：分离效果和k随流动相中%B的变化而变化

2．选择性α的优化

选择性与保留因子间的关系如：α=k2/k1,色谱峰的选择性可以通过调节它的相对保留来改变。色谱条件有机相B%比例、B溶剂类别、柱温、柱子类型、流动相pH值、缓冲液离子浓度、离子对试剂浓度等对色谱的相对保留有影响。

表1：不同分离条件对保留因子、选择性和塔板数的影响。

如例2：B%的改变可以使得k值落在合适的范围内，但需要进一步优化条件。因此通过调整B%比例和柱温，使得六个色谱峰都达到了分离的要求，如d。这个例子是改变选择性的一个简单且典型的示例，通过两因素两水平的改变，设计四个实验，可以达到优化方法的最终要求。

例2：同时改变B%比例及柱温来优化分离度

目前市场上有一些方法开发的软件，如Drylab,ACD lab，可以进行方法开发的实验设计，两个或三个因素，两个或三个水平的变化，得到的分析数据通过专业软件，建立分离度与因素和水平之间的模型，预测分离度在哪个范围条件下可以达到最优的结果。

3．色谱柱柱效优化

根据上图1分离度公式，色谱柱塔板数的提高可以改善色谱峰间的分离度。通过改变色谱柱的长度、粒径和流速，可以改善塔板数N。

理论塔板数公式：N=16(tR/W)2，N=(1/H)L。

一般情况柱子塔板数的提高，意味着保留时间的延长。延长色谱柱、减小粒径和降低流速都可以增加理论塔板数。延长色谱柱和减小粒径的条件改变，会提高系统的压力，这个需要分析工作者注意。

在以前的很长一段时间，由于色谱柱填料是5μm，分析实验室喜欢使用长度为250mm的色谱柱，来提高柱效和分离。随着色谱柱和分析技术的提高，实验室很少有通过延长色谱柱来提高分离效果，现在是通过使用较小粒径（2.7μm,3.0μm,3.5μm）色谱柱，优化保留因子和选择性来获取较短实验时间及满意的分离。

4.小结

分析方法的开发包括分析目标的选择和样品组成，样品的处理，色谱模式的选择，检测器的选择，分离条件的选择，以及潜在问题的评估和解决。

分离度的提高可以通过优化保留因子、选择性和柱效三个因素，其中选择性的改变是最重要的因素，影响选择性的第一要素是色谱柱固定相。优化有机相B%的比例和柱温两个影响因素，一般不复杂的规则样品可以找到满足目标的分离条件。对于复杂不规则样品，需要通过更多的因素和水平的优化，评估样品的疏水性（LogP,LogD）和pKa,选择合适的流动相pH值，通过实验设计和统计学知识，评估多因素和多水平的参数，建立模型，最终选择最优的分析条件，达到分析的目标。

参考文献：

1．现代液相色谱技术导论，陈小明等

2．HPLC方法开发的top3 Tips，爱色谱