摘要：《中国药典》2020年版新增通则<3429>免疫化学法。为更好地理解通则，本文从通则的新增背景、起草过程、国内外药典比较、通则内容解读以及本法在生物制品质量控制中的应用几个方面进行简述，旨在为本通则的顺利实施提供应用指南。

关键词：《中国药典》2020年版；免疫化学法；生物制品；质量控制；应用

Abstract: <3429 >The section Immunochemical Methods has been adopted as a new general chapter in the Chinese Pharmacopoeia 2020.To better understand this general chapter, this paper briefly describes the background, drafting process, comparison of domestic and foreign pharmacopoeias, interpretation of the general chapter and application of the methods in the quality control of biological products. That aims to provide an application guide for the successful implementation of the general chapter.

Key words: Chinese Pharmacopoeia 2020; immunochemical methods; biological products; quality control; application

免疫化学法是基于抗原抗体的特异性、可逆性、非共价结合反应进行检测的一种分析方法，已广泛应用于生物制品的鉴别、纯度/杂质分析、效价测定、稳定性及其他质量属性的考察[1]。除JP外[2]，BP自1993版、EP自第3版和USP自36版均已收载了免疫化学方法的通用技术要求，其定义基本一致，且均收载了多种传统经典/前沿的检测方法，此外USP对免疫学检测方法的选择、方法建立时需考虑的关键因素、方法验证的要求以及数据报告要求的介绍更为全面系统[3-­8]。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版收载了免疫印迹法、免疫斑点法、免疫双扩散法、免疫电泳法、酶免疫分析法、血凝法、单向免疫扩散法和放射免疫法等免疫化学法，常应用于疫苗类制品、抗毒素、抗血清类制品、血液制品和基因工程药的定性和定量检测[9]，但收载的各具体方法较为零散，缺少系统化规范化。为指导并规范生物制品相关免疫化学方法的建立和应用，《中国药典》2020年版新增了通则<3429>免疫化学法，本通则由上海市食品药品检验研究院牵头，联合中国食品药品检定研究院、广东省食品药品检验研究院和江苏省食品药品监督检验研究院共同起草完成。为更好地理解本通则，并推进本通则的顺利实施，本文着重对免疫化学法通则的增订情况和在生物制品质量控制中的应用进行了介绍。

1  现行版国内外药典比较

从总体框架来看，EP10.0/BP2022和USP的免疫化学法总则及其相关通则和应用均分为三个层级结构：EP10.0/BP2022分为免疫化学方法通则、应用于某个品种某个检测项目的具体方法通则和各论项3个层级；而USP中分为免疫化学方法总则、某一大类检测方法通则和各论项3个层级。《中国药典》2020年版的免疫化学法通则及相关通则和应用的框架与EP10.0类似，具体到免疫化学法通则，分为前言和检测方法介绍两大部分，其中前言部分包括了定义、应用范围、分类、方法开发、方法验证总的要求；检测方法部分参考了EP10.0/BP2022，分为标记免疫化学法和非标记免疫化学法，收入的方法类别较EP/BP更多，且方法阐述得更细；在附录部分参考USP将各类方法的优缺点和典型用途汇总，以表格形式呈现。具体详见表1[1，10-12]。

2  本通则主要内容解读与应用

本通则具体可分为前言、标记免疫化学法、非标记免疫化学法和附录四部分内容，包括了10个具体方法，各方法对应的在《中国药典》2020年版应用详见表2。

2.1  前言

前言部分概述了免疫化学法的定义、应用范围及本通则相关要求的适用范围，阐述了免疫化学法的分类，并根据免疫化学分析技术的发展趋势指出非标记免疫化学法可通过采用标记技术转变为标记免疫化学法。此外，值得注意的是，首次提出建立免疫化学法应考虑采用试验设计DOE和控制交叉反应，在验证时应符合的一般要求，并应设置适宜的系统适用性要求，以保证实验结果的准确可靠。

2.2  标记免疫化学法

标记免疫化学法共收录了6个方法，包括酶联免疫吸附法、免疫印迹法、放射免疫分析法3个常规方法和免疫荧光分析法、发光免疫化学法、流式细胞术3个较为前沿的方法。每个方法均包含了定义、分类及适用范围、仪器的一般要求、对标记物的一般要求和常用标记方法和测定法四个部分。其中，标记物与待标记的抗原或抗体形成的结合物为每个标记免疫化学法检测的核心和基础，因此该部分内容针对每个特定的标记免疫化学法而言也是特定的。

2.2.1  酶联免疫吸附法  本法是《中国药典》通则中收载最多的一类检测方法，使用的标记技术主要为酶标记技术，方法一般可分为直接法、间接法、竞争法和夹心法。值得关注的是，为保证我国药典的与时俱进，并与通则<1431>、通则<9401>等要求一致，在结果判定部分提出了临界值的概念及其设定方法(定性分析)，必要时，应报告测定结果的置信区间(用于生物制品效价测定变异度较大定量分析时)。《中国药典》2020年版在通则和各论中涉及到本法应用均不少于10个，且以夹心法为主，应用于检测疫苗中杂蛋白和抗生素残留量居多，亦可用于体外效力、抗原含量和鉴别试验等。此外，随着各类抗体药物的崛起，该法也常用于抗体类药物的鉴别试验、结合活性和竞争结合活性的检测。

2.2.2  免疫印迹法  本法主要分为电泳免疫印迹法和非电泳免疫印迹法，常用的标记物有酶、荧光基团或放射性核素。《中国药典》2020年版收载的通则为<3401>免疫印迹法和<3402>免疫斑点法。免疫印迹法属于电泳印迹法中的单向电泳印迹法，而免疫斑点法属于非电泳印迹法。免疫印迹法可以用于生物技术药物的定性和定量分析，例如各论注射用人白介素11就采用了免疫印迹法进行菌种表达物体鉴定的检查，而在重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)的原液中采用免疫印迹法进行了纯度的检测；免疫斑点法则常用于基因工程药的鉴别试验。

2.2.3  免疫荧光分析法  本法检测基础包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，前者更常用。本法比较特殊的是，某些情况下并非采用荧光素标记，也可利用某些酶的底物经酶作用分解为具有强荧光的酶解产物的原理而采用酶标记抗体。本法采用的技术较为前沿，《中国药典》2020年版在通则项下收载本法2个，并在个别的疫苗各论项下有所提及，主要应用于病毒滴定和鉴别、病毒灭活验证等。

2.2.4  发光免疫化学法  本法根据产生发光反应的体系，可分为生物发光法和化学发光法。前者常用于生物学活性测定、蛋白质印迹等；后者常用在激素类、肿瘤标记物等临床诊断领域。发光标记物标记的抗原或抗体为本法检测的基础，目前常用的技术方法有基于荧光素酶与特定底物反应产生化学发光的信号值的荧光报告基因法、基于放大化学发光亲和均相检测的Alphascreen技术、基于酶解发光底物的化学发光酶促法、基于氧化还原的Almar Blue法等[13-­17]，常用于抗体类药物生物学活性的检测。《中国药典》2020年版收录的通则<3535>康柏西普生物学活性测定法就属于荧光报告基因法。

2.2.5  流式细胞术  本法是将细胞或病毒颗粒与荧光标记技术相结合的一种方法，在本质上属于免疫荧光分析法，因此荧光素的选择和标记方法是本法的关键因素之一。其余注意事项包括细胞的选择(应为单细胞悬液)、设置阴性/阳性对照、仪器补偿设置、数据分析(设定噪音信号阈值和设门)等。《中国药典》2020年版收录通则<3531>尼妥珠单抗相对结合活性测定法就采用了流式细胞术。此外，本法还常用于生物技术药物的细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期等功能性检测。

2.2.6  放射免疫分析法  本法检测的基础为放射性核素标记的抗原或抗体，标记抗原的放射免疫分析法(RIA)为竞争性结合分析，而标记抗体的免疫放射分析法(RIMA)为非竞争性结合分析，其中RIA法应用范围更广，可应用于各类激素、蛋白质、抗原和小分子物质的检测。此外，本法通常使用市售的试剂盒，故应注意符合试剂盒的系统适用性和质量控制要求，并结合日常使用的分析试剂盒情况可根据具体检测方法选用适宜的数学模型。《中国药典》2020年版收录的多个免疫球蛋白类制品各论均采用放射免疫分析法测定抗HBs效价。

2.3  非标记免疫化学法

标记免疫化学法共收录了4个方法，包括免疫沉淀法、免疫电泳法、凝集反应3个常规方法和表面等离子共振法1个较前沿的方法。每个方法均包含了三个部分：定义、分类及适用范围、对仪器及试剂的一般要求和测定法。

2.3.1  免疫沉淀法  本法常用于定性分析，也可用于定量分析。主要分为液体内沉淀反应和凝胶内沉淀反应。《中国药典》2020年版收录通则5个和相关各论3个，其中最常用的为采用免疫双扩散法进行鉴别试验，此外可采用比浊法进行IgG含量测定、IgA残留量测定、人免疫球蛋白Fc段生物学活性等实验，而单向免疫扩散法最经典的应用是流感病毒裂解疫苗血凝素含量的测定。

2.3.2  免疫电泳法  《中国药典》2020年版尽管收载了通则<3404>免疫电泳法，但实际对应的为本法的经典免疫电泳法，而火箭免疫电泳法、对流免疫电泳法和交叉免疫电泳法均由经典免疫电泳法衍生而来。《中国药典》2020年版收录通则1个和相关各论2个，其中通则<3404>免疫电泳法的应用最为广泛，常用于生物制品的鉴别试验，而2个各论则是采用火箭免疫电泳法进行多糖含量的检测。药典未收集对流免疫电泳法和交叉免疫电泳法的相关应用，前者一般用于定性分析，后者可用于定性或定量分析。

2.3.3  凝集反应  本法通常用于定性和半定量分析。《中国药典》2020年版收录了多个通则和相关各论，应用范围包括血清学特性/试验、抗原性试验、凝集试验、鉴别试验等。

2.3.4  表面等离子共振法  本法为较为前沿的免疫化学法，无需标记，可实时检测蛋白质蛋白质、核酸蛋白质等生物分子间相互作用的动力学参数，检测灵敏度高，获取结果快速简便，根据实时测定液固界面抗原抗体复合物形成时偏振光折射的变化来检测生物分子间相互作用的特异性和亲和力大小及定量供试品中待测物的浓度。本法在方法开发时的难点为选择合适的抗体、芯片表面的固定和再生条件。《中国药典》2020年版未收录本法的相关应用，但已有多个单抗品种的进口注册标准收载了表面等离子共振技术作为结合活性的检测方法[18]，另有多篇文献报道了本法在疫苗质量分析中的应用[19-21]。相较于传统的ELISA法，表面等离子共振不需要制备标记抗体，自动化程度高，检测时间短，可以实时反应药物和抗体的结合情况，避免获得假阳性数据。相信表面等离子共振法作为前沿的技术，会有更广泛的应用，建立并收载为法定检验方法。

2.4  附表

通则的附表里列出各类免疫化学法的优缺点及典型用途。以便于对免疫化学法的各种方法的优缺点、仪器设备需求可以有更直观的了解，方便开发方法或药品检定时，更快速方便的选取适合的方法。

3  结语与展望

近二十年，免疫化学法飞速发展，应用领域逐渐广泛，为与国际标准接轨，《中国药典》2020年版首次对各类免疫化学法进行了汇总并制定了相关通则。但是相较于USP和EP，我国药典缺少酶联免疫吸附法、表面等离子共振法等具体免疫化学法的通则，仅收载了具体品种应用酶联免疫吸附法等某种具体的免疫化学法的通则，抑或在各论中提及具体的免疫化学法。在药典未来的增修订时，可以参考国外药典，增订酶联免疫吸附法等免疫化学法的通则，使我国药典的层级结构更加完整。而随着生物技术的发展，必定会涌现更多更新的免疫化学的方法、技术和应用，免疫化学法通则将与时俱进，逐渐完善。此外，随着分析方法生命周期概念的出现，如何科学有效地进行方法设计、开发、验证、应用以及上述过程中涉及的数据分析也是值得重点考虑的问题。例如：方法开发选用酶联免疫吸附法来测定药物结合活性时，对于数据的分析，通常选用四参数作为数据分析的理想模型，此时应参见<1431>生物检定统计法项下的四参数回归计算法；对于方法的验证，考虑到结合活性测定方法为相对效价测定法，可依据通则<9401>生物制品活性/效价测定方法验证指导原则开展相应的方法学验证工作，因此，我们可结合本通则、<1431>生物检定统计法项下的四参数回归计算法和<9401>等多个通则技术要求，制定数据分析策略和方法验证策略。本通则作为免疫化学法总则，结合中国药典收载的具体的方法通则和操作指南，可以在生物制品质量控制中起到积极作用，为免疫化学方法的方法开发、方法验证及完善方法学生命周期管理提供思路和技术指南。

参考文献

[1]  中华人民共和国药典2020年版.三部[S]. 2020: 通则3429  ChP 2020. Vol Ⅲ [S]. 2020：General Chapters 3429

[2]  JP 19 [S]. 2021

[3]  BP 1993 [S]. 1993: 170

[4]  EP 3[S]. 1996：103

[5]  USP 36­NF31[S]. 2013：751

[6]  BP 2018 [S]. 2017：417

[7]  EP 9.0[S]. 2016：239

[8]  USP 40­NF35 [S]. 2016：1337

[9]  中华人民共和国药典2015年版.三部[S]. 2015  ChP 2015. Vol Ⅲ [S]. 2015

[10]  BP 2022 [S]. 2021：451

[11]  EP 10.0[S]. 2019：261

[12]  USP General Chapter <1102>, Docld: 1_GUID­91053CC6­8F24­4B30­9CAE­361569837493_2_en­US

[13]  HAMIYET U. Luciferase reporter assay for unlocking ligand­mediated signaling of GPCRs [J]. Methods Cell Biol, 2019, 149：19

[14]  MUHAMMAD AA, MAYWAN H, ROHANA Y, et al. Development of a NS2B/NS3 protease inhibition assay using AlphaScreen® beads for screening of antidengue activites [J]. Heliyon, 2018, 4(12)：e01023

[15]  WEBER E, SCHORPP K, HADIAN K. Studying OTUD6BOTUB1 ProteinProtein Interaction by LowThroughput GFPTrap Assays and HighThroughput AlphaScreen Assays [J]. Mol Biol, 2021, 2261：381

[16]  ZHOU H, PAN S, TAN H, et al. A novel highsensitive indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on monoclonal antibody for tenuazonic acid (TeA) detection[J]. Eur Food Res Technol, 2022, 248(2)：577

[17]  SHARMA N, ARYA G, KUMARI RM, et al. Evaluation of anticancer activity of silver nanoparticles on the A549 human lung carcinoma cell lines through alamar blue assay [J]. Bio Protoc, 2019, 9(1)：e3131.

[18]  王鸣人，段徐华，邵泓，等. 表面等离子共振(SPR)技术在生物药物质量控制中的应用前景[J].中国药师， 2020，23(11)：2257

WANG MR, DUAN XH, SHAO H, et al. Application prospect of surface plasmon resonance technique in quality control of biopharmaceutical products [J]. China Pharm, 2020, 23(11)：2257

[19]  AZIZA PM, AMINE AK. Critical review of current and emerging quantification methods for the development of influenza vaccine candidates [J]. Vaccine, 2015, 33(44)：5913

[20]  RONALD D, GABRIEL O, KWINTEN S, et al. Comprehensive antigenic map of cleaved soluble HIV1 Envelope Trimer [J]. PloS PATHOG, 2015, 11(3)：e1004767

[21]  QUENTIN C, WALTHERE D, BRUCE L I, et al. Evaluation of potential immunogenicity differences betweenPandemrix™ and Arepanrix™[J]. Hum Vacc Immunother, 2016, 12(9)：2289