生物制品中的病毒防护和去除一直以来是各监管部门重点关注的内容[1,2,3,4]，根据《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则》的要求，生产工艺中必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤，若不包含，则应根据不同品种的特点增加相应的处理方法，并不得改变制品原有的质量。对于从生物组织中提取制成的生物制品，在工艺上应有2个有效工艺步骤从机制上进行互补，对于非脂包膜病毒，应不少于1个工艺有效步骤有效去除和/或灭活作用；对于通过真核细胞表达的生物制品，要求至少有一个工艺有效步骤，能够有效去除和/或灭活非脂包膜病毒。

病毒去除工艺的方法有很多种，常见的有低pH灭活、热力消毒法、辐射消毒法、化学消毒法、多因子协同消毒法、免疫中和消毒法、过滤法、层析法等。

常用的基于真核细胞表达的生物制品的病毒灭活工艺包括低pH灭活和纳滤去病毒工艺，根据ICH Q5A和《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》中的要求，这些步骤在病毒灭活中累积去除率在6个log的水平，对于病毒灭活工艺和产品安全性考虑仅仅实现了部分的能力，而对于病毒去除的工艺要求和安全性要求来说，更期望有更多的方法实现在工艺生产中的病毒去除能力。

《生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案》中介绍，各种层析的病毒去除能力在2~5个log的水平，由于层析工艺是大部分生物制品产品工艺中会用到的，如抗体工艺亲和和阴阳离子交换层析的工艺，再结合低pH灭活与纳滤除病毒的工艺，如此，抗体工艺中的病毒去除能力可达到约20个log下降的水平，由此可以充分保证产品在病毒污染防控工艺的能力，有效地实现产品在此方面的安全性。

图1. 病毒清除结果汇总

当然，由于不同工艺的特点，不同的生物制品工艺需要考虑不同的灭活方式的组合，所用到的缓冲液体系、参数、控制范围也不尽相同。因此不同工艺应当根据自身的特点选择合适的工艺方法和参数，并对这些工艺进行工艺表征研究，以保证病毒灭活或去除效果的有效性。

对残留病毒检测是一个检测能力很差的项目，常见的病毒滴度检测的系统误差也很大，现在很多企业使用qPCR[5]的方法进行的检测也具有一定的局限性，这一类的质量属性属于FDA提到的“检测不能有效表征产品属性”[6]的情况，如病毒的分布不均匀、取样的代表性很差、检测方法系统误差较大等，因此工艺上需要对工艺参数进行非常严格的控制，工艺研究阶段对最差条件、工艺可接受范围、日常运行范围等均需要开展研究，在生产中对各类参数进行严格控制以保证工艺的有效实现。

通过对病毒灭活/去除工艺所用到的设备进行充分的确认、对病毒灭活/去除工艺的验证、对病毒对日常参数的有效控制以及必要的再验证是保证病毒灭活/去除工艺有效的基本方法。

病毒灭活/去除工艺的验证通常需要考虑以下几个要点：

 1 毒种的选择：根据ICH Q5A、《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则》、《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》的要求，需要选择不同类型的指示病毒，对于层析系统用于证明病毒灭活效果所针对的病毒类型需要进行充分考虑，如亲和层析通常在低pH灭活工艺之前，涉及的病毒种类可能更为丰富，并没有要求所有的病毒类型在一步工艺中均能有效去除，因此需要考虑毒种类型，《生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案》中提到的病毒可以作为一个参考。

 2 毒种浓度的考虑：根据《生物制品病毒清除验证的要求及工艺解决方案》给出的经验值，不同的层析系统可以下降2~5个log的水平，通常我们建议毒种浓度应当大于目标值至少1个log，以防止去除后病毒无法检出的情况，进而无法计算实际去除效果。

 3 病毒去除参数的考察：一定应考虑“最差条件”的方法，一般可能包括最高的病毒滴度、最短的时间、如有温度要求时的最低或最高的温度（高温可能导致目标蛋白的不稳定）、最大上样体积和蛋白浓度等。

 4 病毒灭活/去除验证不得在商业化规模厂房进行加样（病毒）验证，因此采用小规模的实验进行，因此对于病毒灭活/去除的小规模至商业化放大时工艺一致性的考虑应当有足够的评估，并对不一致的方面进行讨论，必要时需要在商业化条件下进行参数考察（不加入病毒）。

 5 病毒灭活/去除验证虽然是实验室规模的研究，但为工艺验证中的重要环节，应在QA监管的条件下进行，病毒灭活/去除的验证报告应当有质量负责人的批准。