摘要：报告基因法是目前发展的热原检测新方法，具有操作简单、快速，不使用动物、检测热原谱广，可对热原进行定量等优点，已越来越广泛地应用于生物制品热原检测。2021年10月《体外热原检查法(报告基因法)》在中国药典委网站公示，为更好地理解该公示稿内容，推动该方法的实施，本文以HL60­pNL3.2报告基因热原检查法为例，介绍该公示稿框架和内容，对报告基因法在生物制品中的应用进行了展望，以期为准确应用该方法控制相关产品的质量提供参考。

关键词：体外热原检查法；报告基因法；家兔热原检查法；细菌内毒素检查法；单核细胞活化反应测定法

Abstract: Reporter gene assay is a new pyrogen test developed at present. It has some advantages such as simple and fast operation, animal free, wide pyrogen spectrum and quantitation and so on, and has been more and more widely used in pyrogen detection of biological products.In vitro pyrogen test (reporter gene assay) was published for consultation on the website of the Chinese Pharmacopoeia Committee in October 2021. In order to better understand its content and promote its implementation, taking HL60pNL3.2 reporter gene assay as an example, this paper introduces the framework and content of the draft, prospects the application of the method in biological products, and provides the reference for the accurate application of the method to the quality control of related products.

Key words: in vitro pyrogen test; reporter gene assay; rabbit pyrogen test; bacterial endotoxin test; monocyte activation test

热原是保障非肠道用药，特别是静脉注射用药安全性的重要检查项目之一[1]。传统的检测方法有家兔法和内毒素检测法，两种方法虽是热原检测的经典方法，但均存在一定的局限性[2]。基于热原引起人体发热机理而设计的单核细胞活化反应测定法，具有不使用动物、检测热原谱广，可对热原进行定量等优点[3]，该方法虽已收载于欧洲药典(EP 10.0版)、英国药典(BP 2021)和中国药典(ChP 2020)，但检测周期较长，实验操作较繁琐，因此需发展新的热原检测方法。

随着生物技术的发展，报告基因法因快速、灵敏、操作简便已越来越广泛地应用于生物技术药物质量分析[4]。近年来，对于报告基因方法在热原检测中的研究报道也越来越多[4-­7]，但报告基因热原检查法目前未见收载于欧洲药典、英国药典、美国药典和日本药局方JP等各国药典。中国食品药品检定研究院与上海市食品药品检验研究院通过研究建立基于不同稳转细胞的报告基因热原方法，共同草拟了公示稿草案，经复核单位复核，药典委员会专家讨论后，2021年10月《体外热原检查法(报告基因法)》在中国药典委网站公示，该公示稿不仅统一规范报告基因热原检查法，而且体现中国药典标准的先进性和创新性。为更好地理解该公示稿内容，推动该方法的实施，本文以本实验室建立的HL60­pNL3.2报告基因热原检查法为例，简介了该公示稿框架和内容，对报告基因法在生物制品热原测定中的应用进行了展望，以期为准确应用该方法控制相关产品的质量提供参考。

1  公示稿框架

《体外热原检查法(报告基因法)》公示稿参照《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020年版通则9301注射剂安全性检查法应用指导原则项下“单核细胞活化反应测定法”体例拟定。该公示稿未规定具体的转基因细胞系，适用于所有使用报告基因技术对热原进行测定的方法，从方法的原理和适用性、实验材料、热原污染物限值的确定、溶液的配制、供试品干扰试验、测定法和结果判断八个方面对体外热原检查法(报告基因法)进行了规范。公示稿前言介绍了方法的原理和适用性；实验材料对实验所用的转基因细胞株、试剂和材料提出明确要求；热原污染物限值的确定、确定最大有效稀释倍数、溶液的配制、供试品干扰试验和结果判断均参照《中国药典》2020年版“单核细胞活化反应法”内容拟定；测定法未规定具体的实验参数，仅介绍了方法的大致流程，同时为保障实验结果准确可靠，提出了系统适应用性要求。

2  公示稿内容浅谈

2.1  方法原理和适用性

了解热原作用机理是建立体外热原检查法(报告基因法)的前提。文献报告[8, 9]，热原进入人体后，作用单核细胞上Toll样受体(TLR)，通过相关信号(如NF­κB)通路刺激细胞分泌致炎因子，引起人体发热。根据热原作用机理，构建TLR表达丰富、含热原活化标志物(如NF­κB)和荧光素酶报告基因质粒的稳转细胞株，热原刺激稳转细胞株后，由荧光素酶表达量和热原浓度之间的量效关系，可对供试品热原进行定量检测。

NF­κB是细胞内重要的转录因子，也是目前构建适用于热原检测的稳转细胞株常用的热原活化标志物，不仅在炎症反应，而且在免疫调控、应激反应和细胞凋亡中均起重要的作用[10­-12]，因此，NF­κB信号通路的激活并非热原特异性作用的结果。基于该方法的特点，公示稿明确该方法不适用于本身能刺激或抑制热原标志物(如NF­κB)活化的供试品。在实验操作中，若发现供试品刺激稳转细胞株后，有荧光素酶报告基因的表达，需用内毒素检查法或家兔法进一步进行热原污染确认。

本实验室前期建立了HL60­IL6单核细胞激活测定法[13-­15]，发现人白血病HL60细胞表面Toll样受体2，4，6(TLR2，4和6)均表达丰富，NF­κB信号通路在HL60细胞受热原刺激后分泌致炎因子中扮演重要的作用。根据该作用机制，本实验室将带有NF­κB和荧光素酶报告基因的质粒转染入HL60细胞中，构建了HL60­pNL3.2稳转细胞株，并研究建立了基于HL60­pNL3.2细胞的体外热原检查法(报告基因法)。

2.2  实验材料

因体外热原检查法(报告基因法)使用的试剂、包括细胞培养液、基础培养液、显色剂等均和稳转细胞株有关，公示稿未明确具体的稳转细胞株，规定“根据转基因细胞及建立并验证的方法选择适宜的细胞培养液、维持培养液和显色剂”。本公示稿规定“转基因细胞的构建应符合中国药典《基于基因修饰细胞系的生物检定法指导原则》(拟增)和《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制》的要求”，为适用于热原检测的稳转细胞株的检定明确了方向。同时参照EP10.0版2.6.30  Monocyte­ activation­test对单核细胞系的要求，对稳转细胞株功能性、稳定性提出要求。参照《中国药典》2020年版单核细胞激活测定法内容，本公示稿规定该方法所用的所有耗材均须无热原污染，即所用的商品化的试剂需注明无热原，所用的耗材均需进行去热原处理，公示稿同时列举了常用的去热原方法。

参考《中国药典》关于生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程和EP10.0版2.6.30 Monocyte ­Activation Test(单核细胞活化反应测定法)要求，本实验室对HL60­pNL3.2稳转细胞株功能性、无菌、支原体、外源病毒污染、TLR表达，细胞生长曲线及细胞功能稳定性等进行研究，结果待发表。

2.3  干扰实验

参照《中国药典》2020年版“单核细胞活化反应法”拟定干扰实验内容。规定供试品必须对实验无干扰才可以用该实验进行热原测定。在实际操作中，需计算供试品最大稀释倍数，在最大稀释倍数内，考察供试品对热原检查是否存在干扰。当回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。当回收率不在指定的范围内，须排除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。当首次应用本法进行供试品热原检测时，一般需对3个批号以上的供试品进行干扰实验。参照《中国药典》通则1143“细菌内毒素检查法”，公示稿规定：当供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行供试品的干扰试验。

2.4  测定法和结果判断

测定法因细胞系不同而异，该公示稿未明确具体的转基因细胞系，提出“因不同转基因细胞测定法的试验参数不同，应在试验前建立测定法并加以验证。”参照《中国药典》和EP单核细胞活化反应测定法内容，规定至少测定三个稀释度供试品热原含量，且三个稀释度供试品热原含量均小于规定的限值(CLC)，则供试品符合规定。系统适用性是判断试验结果是否有效的重要标准，为保证实验结果的准确可靠，参照EP和《中国药典》单核细胞活化反应测定法和报告基因法的特点，本公示稿拟定了系统适用性标准。

本实验室通过探讨HL60­pNL3.2稳转细胞株不同接种密度、热原作用细胞不同时间，培养液中不同胎牛血清浓度(FBS)对试验结果的影响，确定了关键实验参数，根据以上参数建立了基于HL60­pNL3.2细胞的体外热原检查法(报告基因法)[16]。参照《中国药典》2020年版分析方法验证指导原则对该方法进行线性、准确度、精密度等指标验证。参照EP 10.0版2.6.30 Monocyte­Activation Test(单核细胞活化反应测定法)cut­off值计算方式，将阴性测定信号的平均值加3SD作为Y值，代入拟合曲线中，计算相应的热原浓度(X值)，即为该方法检测相应热原的检测限。在该方法研究建立的过程中，发现每次实验所得内毒素(LPS)四参数标准曲线及阴性对照OD值均不相同，故每次独立实验所得cutoff值和检测限均不同。而检测限又是进行供试品热原检测时，计算供试品最大稀释倍数最为关键的因素，检测限不同将影响供试品最大稀释倍数的计算，从而导致实验结果的误判。本实验室通过试验，确定该方法检测限为0.05 EU·mL-1，在本实验室按0.05 EU·mL-1计算最大稀释倍数。对于不同实验室，建议每次实验时设立阴性对照，并计算每次实验的cut­off值及检测限，若cut­off值低于可定量范围，则将进行四参数标准曲线拟合的最低热原浓度点作为方法检测限，确定方法的检测限后，再计算样品最大稀释倍数。

3  报告基因热原测定方法在生物制品中的应用

目前关于报告基因法在热原检测中的应用文献报告较多。2017年，Palma[7]在单核细胞系MM6中转染了含NF­κB报告基因的质粒，建立了一种新的报告基因热原检测方法。2018年，中国科学研究院的kaili Li[6]在人腺癌肺泡基底上皮A549细胞中转染入含NF­κB报告基因的质粒，构建了适用于热原测定的稳转细胞株。2019年，中国生物制品检定研究院贺庆[5]在RAW264.7细胞中转染入含NF­κB报告基因，建立了基于RAW264.7细胞的报告基因热原测定方法。

本实验室探讨了HL60­pNL3.2报告基因热原检查法在托珠单抗、雷珠单抗和阿达木单抗等13种单抗制品，水痘疫苗、狂犬疫苗、三价流感疫苗和四价流感病毒裂解疫苗4种疫苗制品，人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、Ⅷ因子3种血液制品热原测定中的应用，发现在最大稀释倍数范围内，除1种单抗制品外，热原在其他19种生物制品中的回收率均在50%～200%之间，HL60pNL3.2报告基因热原检查法可用于该19种生物制品热原测定。其中对热原存在干扰的1种单抗制品，在最大稀释倍数内，热原回收率低于 50%(n=3)，表明该方法不适用于该单抗热原检测，存在干扰的原因需进一步探讨研究。

4  结语与展望

基于我国现阶段的实际情况，并控制体外热原检查法(报告基因法)的初期应用风险，该公示稿仅将体外热原检查法(报告基因法)作为热原检查的补充方法，未强制该方法的执行。

随着生物技术的快速发展，新型生物制品如细胞制品不断获批上市。2021年，两款CAR­T(Chimeric Antigen Receptor T­Cell)细胞治疗产品在国内获批上市，为淋巴瘤患者带来福音，同时热原检测对保证该类细胞制品安全性至关重要。因细胞制品生产工艺特殊、生产经过病毒转导，体外扩增，最终回输入血等一系列过程，涉及环境复杂，仅对其进行内毒素控制，无法保证产品的安全性，而家兔法需要供试品量大，实验成本高，供试品本身可能引起家兔体温升高，对实验结果存在干扰。而且该类产品有效期短，病人需求急，需快速放行，体外热原检查法(报告基因法)适合该类制品的热原检测。另外，腺病毒载体疫苗、核酸疫苗和基因治疗制品都是目前研究的热点，体外热原检查法(报告基因法)在该类制品热原检查中具有良好的应用前景。

参考文献

[1]  李冠民，黄清泉. 热原检查的研究进展及有关问题的探讨[J]. 中国实验动物学杂志，2002，12(4)：232

LI GM, HUANG QQ. Research progress and discussion on pyrogen examination[J]. J Exp Zool, 2002, 12(4)：232

[2]  郭春雪. 热原及其检测方法的研究进展[J]. 科技资讯， 2015, 13(5)：216

GUO CX. Research progress of pyrogen and its detection methods[J]. Sci Technol Inf, 2015, 13(5)：216

[3]  贺庆， 高华. 单核细胞热原检测法的设计与应用要点分析[J]. 中国生物制品学杂志， 2020, 33(8)：961

HE Q, GAO H. Analysis on design and application of monocyte pyrogen assay[J]. Chin J Biol, 2020, 33(8)：961

[4]  刘荔桢， 王灿， 邵泓. 报告基因法在生物技术药物活性检测中的应用[J].中国药师，2021，24(7)：349

LIU LZ，WANG C, SHAO H. Application of reporter gene assay in bioactivity detection of biotechnological drugs[J]. China Pharm, 2021, 24(7)：349

[5]  HE Q, YU C, WANG L, et al. A Novel Reporter Gene Assay for Pyrogen Detection[J]. Jpn J Infect Dis,2020, 73(2)：111

[6]  LI K, XU H, JIANG W, et al. Development and characterization of stable reporter cells for fast and sensitive detection of pyrogen[J]. Anal Biochem, 2018, 557：69

[7]  PALMA L, ROSSETTI F, DOMINICI S, et al. Determination of Interference During In Vitro Pyrogen Detection:Development and Characterization of a Cell­Based Assay[J]. Assay Drug Dev Technol, 2017, 15(2)：64

[8]  ANTHONEY N, FOLDI I, HIDALGO A. Toll and Toll­like receptor signalling in development[J]. Development, 2018, 145(9): 156018

[9]  王鸣人， 王灿， 陈钢. 热原诱导的Toll样受体信号传导通路研究进展[J]. 中国药师，2018，21(3)：480

WANG MR, WANG C, CHEN G. Advances in Tolllike receptor signaling pathway induced by pyrogens[J]. China Pharm,2018, 21(3)：480

[10]  LAWRENCE T. The nuclear factor NF­kappaB pathway in inflammation[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009, 1(6)：a001651

[11]  LIANG H, YANG X, LIU C, et al. Effect of NF­κB signaling pathway on the expression of MIF, TNFalpha, IL6 in the regulation of intervertebral disc degeneration[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact, 2018, 18(4)：551

[12]  DOLCET X, LLOBET D, PALLARES J, et al. NF­κB in development and progression of human cancer [J]. Virchows Arch, 2005, 446(5)：475

[13]  WANG C, WANG MR, LI GM, et al. The application of HL60IL6 assay for in vitro pyrogen detection of CART cells products [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2021, 22(1)：176

[14]  WANG C, ZHAO HB, WANG ZQ, et al. A novel monocytebased pyrogen test based on the mechanism of Human fever reaction [J]. Curr Pharm Anal, 2016, 12(3)：227

[15]  董闪闪，王灿，周勤，等. 单核细胞激活实验在疫苗类生物制品热原检测中的应用研究[J].中国药师，2016，19(5)：870

DONG SS, WANG C, ZHOU Q, et al. Application of monocyte activation test in pyrogen detection of vaccine biological products[J]. China Pharm, 2016, 19 (5): 870