01第一节热力灭菌知识

 

辅助设备指除制药工艺设备、分析仪器之外的其它设备，主要包括热力灭菌设备和环境试验设备。热力灭菌设备主要提供稳定的灭菌/除热原温度，环境试验设备主要提供稳定的温度和（或）湿度环境。

 

热力灭菌知识

 

热力灭菌是制药行业使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动时，随着温度的升高，细胞代谢减缓，细胞的生长及繁殖最终停止。每种细胞对温度的耐受性均有上限，一旦温度超过上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性的破坏，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。

 

对于热力灭菌，湿度对杀灭细菌芽孢起着重要作用，根据湿度的不同，热力灭菌分为湿热灭菌和干热灭菌。湿度达到饱和[相对湿度(RH)为100％时的灭菌方式称为湿热灭菌；相对湿度低于100％条件下的灭菌方式统称干热灭菌。实验数据表明，温度在90～125℃之间，相对湿度在20％～50％时，细菌芽孢较难杀灭；当相对湿度高于50％或低于20％时较易杀灭。

 

从灭菌机理上说，湿热灭菌是使微生物的蛋白质及核酸变性而杀灭微生物，湿热灭菌所需的温度较低。干热灭菌是利用高温使微生物或脱氧核糖核酸酶等生物高分子产生非特异性氧化而杀灭微生物，干热灭菌需要较高的温度条件。

 

在恒定的热力灭菌条件下，同一种微生物的死亡遵循一级动力学规则（也叫存活曲线）。微生物死亡速率是微生物的耐热参数D和杀灭时间的函数，它与灭菌程序中微生物的数量无关。存活曲线可以用下面的半对数一级动力模式来表示：

 

LogNF=Log No-F(T,z)/DT

 

公式中：

 

No	灭菌前微生物数量
NF	灭菌F分钟后微生物存活数量
DT	温度T下将微生物杀灭90％或使之下降一个对数单位所需的时间
z	使微生物的D值变化一个对数单位所需升高或下降的温度
F(T,z)	灭菌程序在确定的温度系数z下的T℃等效灭菌时间

 

半对数模型的微生物存活曲线如下图所示：

 

 

图1半对数模型的微生物存活曲线

 

热力灭菌能量传递的方式分为传导、对流和辐射。

 

传导：

 

传导是以分子振动的形式传递能量，如能量通过容器壁传递给被灭菌的液体；能量通过与灭菌介质的直接接触传递到物体表面（例如蒸汽或热水）。

 

对流：

 

对流是与运动流体的接触而产生的能量转移。如容器中被灭菌的液体自然流动称为自然对流；如果通过风扇或泵促使液体流动称为强制对流。

 

辐射：

 

辐射是能量以电磁波形式的传递。辐射是真空干燥阶段能量传递的主要方式。

 

热力灭菌相关术语在各指南种描述有所不同，本书将参考术语阐述清晰的一些指南对热力灭菌常用术语进行解释，热力灭菌常用术语如下：

 

D值：

 

微生物的耐受参数，指在特定温度下使微生物的数量下降一个对数单位或杀灭90％所需要的时间。D值越大，说明该微生物的耐热性越强。D值需注明参照温度，即以DT表示，如D121℃=1.5分钟，指在121℃条件下，杀灭90%的微生物需要1.5分钟。

 

Z值：

 

使微生物的D值变化一个对数单位所需要升高或下降的温度。常用于累计一个灭菌程序在加热和冷却阶段随温度变化的杀灭时间。

 

Z＝(T1－T2)／(1gD2—lgD1)

 

灭菌率（Lethal Rate，L）

 

指某一温度T（℃）下灭菌1分钟所获取的标准灭菌时间，用L表示。

 

L(Tref,z)=10(T-Tref)/z=Fref/FT=Dref/DT

 

Tref:指标准灭菌温度

 

F0：

 

是指Z取10℃时，一个湿热灭菌程序赋予被灭菌品121℃下灭菌的等效灭菌时间。

 

FH：

 

一个干热灭菌程序赋予被灭菌品170℃下灭菌的等效灭菌时间。干热灭菌时Z取20℃；干热除热原时Z取值54℃。

 

FPHY：

 

物理杀灭时间，指以灭菌程序的物理参数计算的杀灭时间。FPHY是灭菌率L对时间的积分值。

 

FPHY=ΔtΣ10(T-Tref)/z

 

FBIO：

 

生物杀灭时间，它是生物指示剂挑战试验系统中微生物实际杀灭效果的量度。

 

FBIO= DT×(LogN0- Log NF)

 

无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL）

 

产品/物品经灭菌后微生物残存的概率。描述灭菌后非无菌单元概率。在制药工业中，预期的设计终点是无菌保证水平≤10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。

 

热分布测试：

 

对腔室中整个装载区域加热介质温度的测试，测试用探头不应接触任何物品。

 

热穿透测试：

 

为评价灭菌柜腔室内传递给被灭菌品能量而进行的温度测试，测试用探头应放置于被灭菌物品中。

 

平衡时间：

 

平衡时间是指灭菌腔室（腔室参照温度通常是排水口探头温度）达到最低设定灭菌温度和装载达到最低设定灭菌温度之间的时间间隔，后者由加热最慢的热穿透探头测得。它体现了灭菌柜去除装载中空气并对装载加热的能力。

 

02第二节灭菌法规指南要求汇总

 

（一）中国GMP2010版附录1无菌药品

 

第六十三条 任何灭菌工艺在投入使用前，必须采用物理检测手段和生物指示剂，验证其对产品或物品的适用性及所有部位达到了灭菌效果。

 

第六十四条 应当定期对灭菌工艺的有效性进行再验证（每年至少一次）。设备重大变更后，须进行再验证。应当保存再验证记录。

 

第六十六条 应当通过验证确认灭菌设备腔室内待灭菌产品和物品的装载方式。

 

第七十条 热力灭菌通常有湿热灭菌和干热灭菌，应当符合以下要求：

 

（1）在验证和生产过程中，用于监测或记录的温度探头与用于控制的温度探头应当分别设置，设置的位置应当通过验证确定。每次灭菌均应记录灭菌过程的时间-温度曲线。

 

采用自控和监测系统的，应当经过验证，保证符合关键工艺的要求。自控和监测系统应当能够记录系统以及工艺运行过程中出现的故障，并有操作人员监控。应当定期将独立的温度显示器的读数与灭菌过程中记录获得的图谱进行对照。

 

（2）可使用化学或生物指示剂监控灭菌工艺，但不得替代物理测试。

 

（3）应当监测每种装载方式所需升温时间，且从所有被灭菌产品或物品达到设定的灭菌温度后开始计算灭菌时间。

 

（4）应当有措施防止已灭菌产品或物品在冷却过程中被污染。除非能证明生产过程中可剔除任何渗漏的产品或物品，任何与产品或物品相接触的冷却用介质（液体或气体）应当经过灭菌或除菌处理。

 

第七十一条 湿热灭菌应当符合以下要求：

 

（1）湿热灭菌工艺监测的参数应当包括灭菌时间、温度或压力。

 

腔室底部装有排水口的灭菌柜，必要时应当测定并记录该点在灭菌全过程中的温度数据。灭菌工艺中包括抽真空操作的，应当定期对腔室作检漏测试。

 

（2）除已密封的产品外，被灭菌物品应当用合适的材料适当包扎，所用材料及包扎方式应当有利于空气排放、蒸汽穿透并在灭菌后能防止污染。在规定的温度和时间内，被灭菌物品所有部位均应与灭菌介质充分接触。

 

第七十二条 干热灭菌符合以下要求：

 

（1）干热灭菌时，灭菌柜腔室内的空气应当循环并保持正压，阻止非无菌空气进入。进入腔室的空气应当经过高效过滤器过滤，高效过滤器应当经过完整性测试。

 

（2）干热灭菌用于去除热原时，验证应当包括细菌内毒素挑战试验。

 

（3）干热灭菌过程中的温度、时间和腔室内、外压差应当有记录。

 

（二）EN285/GB8599（针对湿热灭菌柜）

 

灭菌温度范围下限为灭菌温度，上限应不超过灭菌温度+3℃。

 

灭菌阶段同一时刻各点之间的差值应不超过2℃

 

对于灭菌温度分别为121℃、126℃和134℃的灭菌器，维持时间应分别不小于15min、10min和3min。

 

（三）PDATM01（针对湿热灭菌柜）

 

空载温度分布研究---多孔负载程序

 

在暴露平衡阶段，腔室内温度应不超过平均温度的1.5℃。

 

蒸汽灭菌柜的温度控制探头/记录仪与附近的温度探头温度差值不大于1.0℃。

 

所有热电偶（除疏水口处），同一时刻差值（最大-最小）不超过2℃。

 

灭菌柜的打印输出所示的控制器灭菌时间在预定的暴露阶段误差不大于1%。

 

灭菌柜打印输出所示的压力与打印输出的温度与对应的标准饱和蒸汽表所显示的压力的误差不大于1.6%。

 

最冷点（由热分布研究产生的）应是一致的和可识别的。

 

三次连续（中间无失败运行）成功的运行是必须的。

 

空载温度分布研究---无孔负载程序

 

在暴露平衡阶段，腔室内温度应不超过平均温度的1.0℃。

 

蒸汽灭菌柜的温度控制探头/记录仪与附近的温度探头温度差值不大于1.0℃。

 

所有热电偶（除疏水口处），同一时刻差值（最大-最小）不超过1.5℃。

 

在灭菌阶段，任何热电偶的温度波动不超过1℃。

 

灭菌柜的打印输出所示的控制器灭菌时间与预定阶段误差不大于1%。

 

三次连续（中间无失败运行）成功的运行是必须的。

 

负载热穿透/生物学挑战研究---多孔负载

 

所有热穿透的探头F0值不小于15分钟。

 

灭菌柜的打印输出所示的控制器灭菌时间在预定的暴露阶段误差不大于1%。

 

灭菌柜打印输出所示的压力与打印输出的温度与对应的标准饱和蒸汽表所显示的压力的误差不大于1.6%。

 

最冷点（由最小F0产生的）应一致的和可识别的。

 

三次连续（中间无失败运行）成功的运行是必须的。

 

可用的生物指示剂孢子含量不少于1.0x106，D121°C值不小于1分钟。

 

灭菌后生物指示剂培养后与阳性对照相比应呈阴性。

 

负载热穿透/生物学挑战研究---无孔负载

 

所有热穿透的探头F0值都能达到预期的范围（包括最大值和最小值）。

 

灭菌柜的打印输出所示的控制器灭菌时间在预定的暴露阶段误差不大于1%。

 

灭菌柜打印输出所示的压力与指定的规范中规定的压力误差不大于1.6%。

 

冷点和热点（由最小F0与最大F0产生的）在所有运行中应是一致的和清晰的。

 

生物指示剂应有确定的含量及耐热性。

 

三次连续（中间无失败运行）成功的运行是必须的。

 

03第三节湿热灭菌程序开发（一）

 

热力灭菌设备

 

热力灭菌设备分为湿热灭菌设备和干热灭菌设备。

 

湿热灭菌设备：按灭菌介质不同分为饱和蒸汽灭菌设备和空气加压灭菌设备。

 

饱和蒸汽灭菌设备：脉动真空蒸汽灭菌柜、重力置换蒸汽灭菌柜，带灭菌功能的胶塞清洗机、在线灭菌系统（如罐体及冻干机SIP功能）

 

空气加压灭菌设备：蒸汽-空气混合灭菌柜，过热水灭菌柜。

 

干热灭菌设备：按使用方式可分为间歇式和连续式。

 

间歇式干热灭菌设备：如干热灭菌柜，用于金属器具、设备部件灭菌及除热原。

 

连续式干热灭菌设备：如隧道烘箱，用于安瓶瓶或因林瓶灭菌及除热原。

 

湿热灭菌程序的开发

 

为了满足特定物品的无菌要求和质量稳定性，有必要开发与被灭菌物品相适应的湿热灭菌程序，灭菌程序的开发是确定灭菌工艺的各项物理参数的过程。灭菌程序的开发应列入正式的开发计划并有相应的文件和记录。本节将以湿热灭菌柜为例进行湿热灭菌程序的开发，图2是PDA湿热灭菌方法选择决策树，对程序的开发有着指导作用。

 

 

图2PDA湿热灭菌方法选择决策树

 

设计灭菌方法

 

灭菌程序设计方法主要有两种：过度杀灭法和残存概率法。两种方法都可以使被灭菌物品达到相同的无菌保证水平，选择哪种设计方法很大程度上取决于被灭菌物品的热稳定性。过度灭杀法要求的热能较大，被灭菌物品降解的可能性较大；残存概率法要求的热能较小，有利于被灭菌物品的稳定性。

 

过度杀灭法

 

过度杀灭法的目标是确保灭菌程序赋予被灭菌物品达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌品在灭菌前的微生物含量以及污染菌的耐热性。设计过度杀灭法时，通常假设初始菌的数量及其耐热参数如下：

 

N0=106，D121℃=1分钟，z=10℃

 

为了达到微生物残存概率为一百万分之一，NF=10-6

 

利用上面的以上数值，可以计算出达到设计要求的FPHY和FBIO如下：

 

F0＝FPHY＝FBIO＝D121℃×（LogN0－LogNF）＝12分钟

 

因此一个用过度杀灭法设计的灭菌程序可以定义为“一个被灭菌品获得的F0至少为12分钟的灭菌程序”。欧盟在最终灭菌制剂的法规中，将对过度杀灭定义为“湿热灭菌121℃下15分钟”

 

在自然环境中，很少发现微生物的D121℃超过0.5分钟。在过度杀灭法中所假设的污染菌含量及其耐热性都高于实际数。在过度杀灭设计法中，由于该方法已经对微生物含量及耐热性作了最大程度的估计，因此从无菌保证的设计角度看，没必要对被灭菌品进行常规的灭菌前污染菌监控。

 

残存概率法

 

不耐热产品或物品的灭菌不能使用过度杀灭法，这就需要所建立的灭菌程序必须能恰当地杀灭微生物，但不能导致产品或物品的降解。这样的灭菌周期的建立有赖于研究产品或物品上的微生物数量和耐热性。一旦确定了微生物的数量和耐热性，就可以设计出一个能达到SAL小于10-6的灭菌程序。

 

残存概率法设计时，N0和DT的取值是基于产品或物品在灭菌前污染菌含量检测数据，另需加上安全余地，它取决于以下方面：

 

专业判断

 

生物负荷数据的范围

 

对产品生物负荷常规测试的程度。

 

按GMP规范生产的产品，实际微生物初始数量应该很低，通常每个容器1-100个菌。通常说来，只有环境中形成的芽孢或从产品分离的芽孢才需要测试D值。将产品在80-100℃下加热10-15分钟，可以筛选掉耐热性差的微生物。DT值的选择应将初始微生物试验中检出的最耐热菌的安全系数考虑在内。所选定的安全系数反过来又与初始微生物的数量和耐热性测试的频率和程度相关。

 

假设产品的生物负荷测试中：

 

N0＝102

 

D121℃＝1分钟

 

Z＝10℃

 

利用以上数值，可以计算出经121℃灭菌，微生物残存概率小于10-6所需的FPHY和FBIO如下：

 

F0＝FPHY＝FBIO＝D121℃×（LogN0－LogNF）＝8分钟

 

残存概率法设计的灭菌工艺，通常要求对每批产品灭菌前进行微生物含量及耐热性测试，积累微生物污染的数据。如果长期以来的数据证明在实际的GMP控制条件下，污染水平很低，且检不到耐热菌，污染菌监控的方案可作适当调整。

 

确定装载类型

 

灭菌工艺开发的下一个步骤是确定灭菌物品的种类，确定装载类型。灭菌物品通常划分为多孔/坚硬装载和液体装载。不同装载类型应选择合适的灭菌方法。

 

多孔/坚硬装载

 

多孔/坚硬装载是指直接接触饱和蒸汽来实现灭菌的物品。当蒸汽在被灭菌物品的表面冷凝时，发生热量转移。多孔/固体物品包括但不局限于下述内容：

 

过滤器（薄膜式过滤器、筒式过滤器、预过滤器等）

 

胶塞和其它聚合物密封件

 

管道和软管

 

工作服

 

清洁设备

 

设备部件

 

液体装载

 

液体装载的灭菌通过传导和(或)对流作用，将能量传递给容器中的内容物。液体装载包括但不局限于以下内容：

 

最终容器（如小瓶、袋、瓶子、针筒或安瓿）的药液（溶液、悬浮液和/或乳剂）

 

实验后或生产后需处理的含有潜在致病微生物的废液

 

04第四节 湿热灭菌程序开发（二）

 

选择灭菌程序

 

对于湿热灭菌来说，有两种常用的灭种程序：饱和蒸汽灭菌程序和空气加压灭菌程序。饱和蒸汽灭菌程序通常用于多孔/坚硬装载灭菌，空气加压灭菌程序通常用于液体装载灭菌。下面对这两种灭菌程序作简要介绍：

 

饱和蒸汽灭菌程序

 

按灭菌前排除空气的方式不同，饱和蒸汽灭菌程序分为脉动真空灭菌程序和重力置换灭菌程序。

 

脉动真空灭菌程序

 

脉动真空灭菌程序在灭菌前通过机械真空泵将空气从腔室中抽走，常用于难以去除空气的多孔/坚硬装载的灭菌，比如软管、过滤器和灌装机部件。灭菌程序开始之前，对装载的处理很重要。如果每次抽真空至0.1个大气压，那么每个脉冲（抽真空-充蒸汽）将使灭菌柜内的空气减少90%或者1个对数单位。三次脉冲可使灭菌柜内的空气下降3个对数单位，有效地将空气去除99.9%。为了使装载处于正常状态，可能另需正压脉冲（充蒸汽至高于大气压，避免空气进入腔室）。通过这个方法，提高去除空气的效率，缩短平衡时间。在制定灭菌程序时，要准确地确定脉冲的次数和类型。

 

重力置换灭菌程序。

 

重力置换灭菌程序的原理在于灭菌柜腔室中的冷空气比进入的蒸汽重，冷空气被从腔室顶部输入的蒸汽往下排挤到腔室的底部，并通过腔室底部的排水管排出。蒸汽往往通过导流档板或散流器输至灭菌柜腔室。蒸汽注入腔室的速度非常关键，如果蒸汽进入过快或分布不合理，装载的顶部或周围可能会夹带空气层。如果进汽过于缓慢，空气受热而扩散入蒸汽中，从而使排除空气更加困难。

 

重力置换灭菌程序排除空气的效率低于脉动真空灭菌程序，对排气比较困难的装载而言，不建议采用这类灭菌程序。

 

空气加压灭菌程序

 

对于液体装载灭菌，液体容器顶部常留有小部分气体(空气、氮气或其他惰性气体)。当液体被加热时，顶部气体膨胀，容器中的压力随之增大。冷却阶段，容器内的温度高于容器外，容器内的压力也会比腔室内压力大。为保持容器的形状和密封完好性，需空气加压，增大腔室的压力，降低腔室和容器内的压差。加压灭菌程序通常采用无油压缩空气。通入腔室的空气须先经过除菌过滤器过滤。为防止加入冷空气会引起腔室内的温度波动，空气在通入腔室前要预热。常见的空气加压程序有蒸汽-空气混合灭菌程序（SAM）和过热水灭菌程序。

 

蒸汽-空气混合灭菌程序

 

程序以空气和蒸汽混合物为加热介质。当蒸汽中加入空气，产生高于一定温度下饱和蒸汽压的压力，这种灭菌程序即为蒸汽-空气混合灭菌程序。与饱和蒸汽灭菌相比，它的热传递速率低。灭菌结束后，常见的冷却方法是向灭菌柜夹套通入冷却水，保持空气循环冷却。也可通过在装载上方喷淋冷却水使其降温。

 

过热水灭菌程序。

 

过热水灭菌程序是指在空气加压条件下，以过热水为加热介质进行灭菌。这个程序中，加压是为了保持水在高温下的液体状态。

 

多孔/坚硬装载灭菌程序开发要素

 

多孔/坚硬装载灭菌重现性和获取无菌保证水平的最大风险是单个产品中可能夹带的空气，因此灭菌前，应确保充分地排除灭菌柜腔室和产品中的空气，同时灭菌过程确保向灭菌柜提供干饱和蒸汽。通常多孔/坚硬装载灭菌程序的开发需要从以下方面进行考虑：

 

装载最冷点

 

在腔室热穿透试验前进行热分布研究，画出装载的分布图，确定灭菌品中适当的监控点位置，确定装载中最难加热的部位。

 

装载的温度测试应取最难加热的物品（如质量大的、易包藏空气的、长的软管，或这类特性兼备的装载物品）。作温度分布图时，要比较装载类型对加热的影响（如比较排除空气的难易及大装载加热的难易程度）并将温度探头放置在最难加热的位置。

 

装载准备

 

多孔/坚硬装载的准备方式可有多种，包括但并不局限于以下示例：

 

用可穿透蒸汽和空气的包装材料将装载包扎（如不脱落纤维的纸或其他聚合包装材料）

 

加盖但不封闭的桶/盒（如带孔的不锈钢桶/盒)

 

将装载放在静止或旋转桶式的容器中（如胶塞）

 

无菌生产中所用的物品必须加以包装或包扎，以便在使用之前保持无菌状态。包装材料需考虑空气及冷凝水的排除，避免微生物污染。

 

装载方式

 

在运行确认后及性能确认前，要确认装载的类型和方式，并有相应记录。装载方式的确定应考虑以下方面：

 

装载不能接触腔室内壁。

 

尽可能减小金属容器平面间的接触以及与灭菌车之间的接触。

 

为方便去除空气及冷凝水，明确装载物的方位并有相应记录，如将桶倒置。

 

质量大的装载应放在腔室中较低的架子上，尽量减少冷凝水所致的装载潮湿。

 

控制灭菌柜中装载物的数量，如果预期装载物的量是变化的，则需确定最小和最大装载量。

 

如果确认表明物品的摆放位置不影响灭菌效果，那么装载方式是可变的。

 

应制定适当的SOP，便于相关操作人员执行操作。

 

运行参数

 

建立灭菌程序的关键要素是确定运行参数，以满足灭菌工艺设计的目标并确定它们属关键因素或重要因素。表1列出了建立多孔/坚硬装载灭菌程序参数时需要考虑的因素。

 

表1多孔/坚硬装载灭菌程序主要参数

 

 

过程	参数	影响因素
全过程	夹套的温度和/或压力	夹套温度不能超过或者明显低于腔室的灭菌温度。要控制温度避免过热或者过冷。通常系重要参数。
升温阶段	真空/脉冲的次数、范围和持续时间（如果适用）	它们决定去除多孔物品中空气和达到适当平衡的时间。通常是关键参数。
	充蒸汽的正脉冲次数、范围和持续时间（如果适用）	蒸汽的正脉冲是（灭菌前）创造装载灭菌条件的有效方法。通常是重要参数。
	腔室加热时间	饱和蒸汽灭菌与所供的蒸汽相关，可设报警限，对非正常的加热时间报警。
灭菌阶段	灭菌时间	每个灭菌程序均需验证，并需监控/记录的关键参数。
	温度设定值	验证过程中确认的关键参数。
	独立的排水或腔室温度	每个灭菌程序均需验证，并需监控/记录的关键参数。
	装载探头的温度	这不属控制参数，且在多孔/固体物品的灭菌中没有广泛应用。
	腔室压力	对饱和蒸汽灭菌而言，可用以确认饱和蒸汽灭菌的条件。可能是关键因素，这要根据控制系统的情况来定。
	装载探头最低F0值	如采用装载探头，这是一个关键参数。
冷却阶段	干燥时间	下列因素可能会提高干燥效率：加热、高真空、脉冲或这些因素的组合。装载有特定的干燥要求时，它是灭菌程序的重要参数。
	补气速率（消除真空的速率）	可以设定，以保护包装和过滤器的完整性；但不具有代表性。是可能的重要参数。

 

关键参数涉及产品的安全和有效性，关键参数不合格可能会导致灭菌的失败。重要参数保证日常灭菌运行处于“受控”状态，重要参数不合格时需调查并有文件证明对灭菌装载处理的合理性。

 

平衡时间

 

平衡时间表示去除空气并使装载达到灭菌条件的能力。即使最终达到了设定的灭菌温度，平衡时间的延长也表示去除空气或加热能力的不足。在程序开发中，尽可能减小平衡时间，采用以下方法可缩短平衡时间：

 

确认装载正确放置，有效排除空气（如胶管不受挤压）

 

增加真空或蒸汽正脉冲的次数

 

提高真空脉冲的真空度

 

优化装载方式

 

05第五节 湿热灭菌程序开发（三）

 

液体装载灭菌程序开发要素

 

封闭容器中液体的湿热灭菌，是通过加热介质将热能经内包装容器传递给容器内液体来实现的。在浸入-喷淋式灭菌柜中，可以使用过热水和压缩空气。这类灭菌方式通常不需要排除腔室中的空气就可进行灭菌，但一般要求加热/冷却介质强制循环，以促进物品加热/冷却过程中的热传递。

 

在建立最终灭菌产品的灭菌程序中，最需要关注的问题是保证装载中最低温度点获得足够的杀灭时间，又要保证装载中高温点的产品符合产品质量要求，灭菌程序开发时应注意以下方面：

 

在确认和常规灭菌过程中，装载物要处于相同的位置。

 

输入装载的热量应一致，不应过高或过低。

 

装载的生物负荷应符合设定标准。

 

有足够的空气增压值（如果是采用空气加压的程序），使容器的破损和变形降低到最小程度。

 

灭菌柜应控制产品的冷却速率，避免产品的爆裂。

 

生物指示剂在产品中的耐热性。

 

应根据加热介质的类型（饱和蒸汽、蒸汽-空气混合物或过热水）和液体容器的类型（如玻璃容器、软袋、塑瓶）设计灭菌柜的托盘/架子。

 

每种容器及装载规格均应通过热穿透试验来确认装载的冷区及热区。通常液体装载灭菌程序的开发。需要从以下方面进行考虑：

 

冷点位置

 

容器的冷点是灭菌过程最低F0值的位置。对于大容量注射剂，冷点位于产品几何中心和纵轴的底部（如图1所示），此冷点需要确认。在小容量注射剂中，冷点的定位并不典型，因为溶液升温的速率几乎与灭菌柜相同。冷点的位置也受容器方位的影响。当容器旋转时，可能找不到可辨识的冷点。

 

 

图1液体容器中探头位置示例

 

装载方式

 

对于密封的液体装载，装载方式需要考虑以下方面：

 

蒸汽、蒸汽-空气混合物或过热水对装载容器的有效穿透，使整个装载具有一致的灭菌条件。

 

在灭菌后，确定装载有效冷却的范围，以保护产品的质量特性。如：培养基灭菌后的促菌生长的能力。

 

恰当的压力平衡，使容器的破损和变形降低至最小程度。

 

如果装载容器大小不同，应明确装载的最少数量和最多数量。

 

运行参数

 

表1列出了建立液体装载灭菌程序参数时需要考虑的因素：

 

表1装载灭菌程序主要参数

 

过程	参数	影响因素
全过程	夹套的温度及/或压力	在过热水循环中，通常不用夹套。如果使用，夹套的温度不应高于灭菌柜腔室的温度。
	SAM法中风扇的转数	最低要求：风扇的故障应能启动警报。转速应是重要参数。
	摇动/旋转速度	最低要求：需要时，摇动/旋转故障应能启动警报。摇动/旋转速度应看作重要参数。
	过热水循环流速	最低要求：泵的故障应启动警报器。泵的操作应是重要参数
加热阶段	腔室的水位（过热水法）	确定最低水位并设报警。潜在的重要参数。
	腔室加热时间	对于饱和蒸汽灭菌法而言，它与供汽相关。应设加热时间长短的警报限度。SAM和过热水法灭菌潜在的重要参数。
	腔室加热速率	在任何装载条件下，为使加热时间及热分布具有重现性，应为SAM和过热水工艺确定其控制功能，系潜在的重要参数
	升压速率	对于一些使用SAM或过热水灭菌法的产品，保持容器的特性（如形状及针筒中胶塞的位置）需要有一定的升压速率。系潜在的重要参数。
灭菌阶段	设定温度点	这是验证过程中的关键控制点
	灭菌时间	如果不使用装载探头，这是一个关键参数。在每个灭菌程序中都需要对这个变量进行确认/监控/记录。
	腔室的压力	空气增压灭菌程序的压力是一个由用户定义的参数。根据所用控制系统的情况，它可能是饱和蒸汽潜在的关键参数。
	灭菌期间独立的加热介质的温度	如果不使用装载探头，这是一个关键参数。每次灭菌时，要监控/记录这个温度。
	超过特定的最低温度的装载探头时间	可适用于有特定时间/温度要求的产品，以代替F0的要求。这是一个潜在的关键或重要参数。
	装载探头的最低F0值	当采用装载探头时，这是一个关键参数。
冷却阶段	装载探头的最小F0值	当采用装载探头时，这是一个关键参数。
	装载探头最大F0值	当采用装载探头时，这是一个关键参数。
	降温速率	过热水及SAM程序中，需要设定的控制参数。
	降压速率	对于采用SAM或过热水法的灭菌程序，保持特定的容器特性（例如形状、注射器塞子的位置）需控制一定的速率。系容器完好性潜在的重要参数。
	装载冷却时间	灭菌后，经一定时间，产品达到适当温度，以便进一步加工（如贴签，装箱）。通常不是关键及重要参数。

 

06第六节 湿热灭菌设备的确认

 

湿热灭菌设备的确认范围和程度应当经过风险评估来确定，可采用系统影响性评估（SIA）及部件关键性评估（CCA）对设备进行全面评估。灭菌设备作为关键设备，需要执行的确认通常包括设计确认、安装确认、运行确认、性能确认。本节将以饱和蒸汽灭菌柜为例，对湿热灭菌设备确认的重点项目作简要阐述。

 

运行确认---联锁功能

 

对于双扉蒸汽灭菌柜，设备应具备以下安全联锁功能：

 

灭菌柜在正常工作条件下，当门未锁紧时，联锁功能禁止蒸汽进入灭菌室内；

 

连锁功能控制灭菌柜的门在室内压力完全释放前禁止打开；

 

在灭菌周期运行过程中联锁功能禁止打开灭菌柜两侧门；

 

除非维护的需要，联锁功能应禁止同时打开两个门；

 

在未显示灭菌周期结束之前，联锁功能禁止打开卸载门。

 

BD测试和真空泄漏测试程序结束后，联锁功能禁止打开卸载门。

 

运行确认---BD测试 Bowie and Dick test

 

BD测试用于评估灭菌柜空载条件下空气去除能力和蒸汽穿透能力的一种试验。BD测试通常是按测试包说明将测试包放置在灭菌腔内，进行简短的空载灭菌，查看测试包中的指示卡是否颜色变化均匀。导致BD测试失败有以下可能的原因：

 

空气去除不完全；

 

在去除空气的阶段出现了真空泄漏；

 

在供蒸汽过程中出现了非冷凝气体。

 

运行确认---真空泄露测试

 

真空泄露测试主要用于用于脉动真空灭菌柜，确认在真空状态下，漏入灭菌室的气体量不足以阻碍蒸汽渗透负载，并且不会导致在干燥期间负载受到污染，真空泄露测试步骤如下：

 

灭菌室为空载的条件下，开始运行真空泄露程序。

 

开启真空泵，当灭菌室压力为7kPa或者以下的时候，关闭所有与灭菌室相连的阀门，停止真空泵。观察并记录时间（t1）和压力（p1）。

 

至少等待300s，但不超过600s，让灭菌室中的冷凝水气化，观察并记录灭菌柜灭菌室内的压力（p2）和时间（t2）。

 

再经过（600±10）s之后，观察并记录一次压力（p3）和时间（t3）。

 

真空泄露率：V= (p3-p2)/(t3-t2)应不超过0.13 kPa/min。

 

注意：如果(p2-p1)的数值大于2kPa，可能是由于灭菌室开始时有过量的冷凝水。

 

运行确认---空载热分布测试

 

空载热分布测试是确认空载条件下灭菌室内的温度均匀性和灭菌介质的稳定性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。空载热分布测试一般需要注意以下几点：

 

测试用探头在布点时不应与腔室内金属(如内壁、架子等)接触。

 

测试用探头在灭菌腔室内几何均匀分布。

 

至少有一支测试探头布于设备自身控制系统的温度传感器附近。

 

至少选择10个经过校正的温度探头，（探头的校准偏差应小于±0.5℃，当验证设备有特殊要求时，可依据相关要求进行校准），连续重复三次测试应符合要求。

 

性能确认---负载热分布测试及负载热穿透测试

 

在负载条件下对热分布及热穿透研究，测试一般需要注意以下几点：

 

应尽可能使用待灭菌产品，如果采用模拟物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。

 

热分布探头的数量和安放的位置一般同空载热分布试验。

 

热分布探头不能接触带灭菌的装载物品；热穿透探头必须布于装载内部。

 

热穿透探头布点位置应有代表性，获得的数据可以确定最难灭菌的位置。

 

采用热穿透数据来计算物理杀灭时间FPHY。

 

性能确认---生物指示剂挑战测试

 

生物指示剂挑战测试主要目的是获取所要验证的灭菌程序杀灭微生物的实际数据，从而证明所建立的灭菌程序达到了程序设计中建立的生物杀灭时间(FBIO)。生物指示剂挑战测试一般需要注意以下几点：

 

所选用生物指示剂的数量应比装载物品的生物负荷高，耐热性应比生物负荷强。

 

评价FPHY和FBIO间的关系，生物指示剂应尽可能靠近温度探头的放置部位。

 

在放置温度探头和生物指示剂时，要避免人为地增加或减少某一区域空气的去除或蒸汽的穿透。

 

用于挑战测试的生物指示剂通常为嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子，D值通常为1.5~3.0分钟，每片（或每瓶）活孢子数5×105~5×106个。生物指示剂用量的计算有两种方法：残存曲线法（按对数规则计算），阴性分数法(也称不生长分数法)。

 

残存曲线法

 

计算生物指示剂的用量可以采用以下公式：

 

F0＝DBi(lgNBi+1)

 

备注：DBi是生物指示剂的D值，NBi是生物指示剂的孢子含量。为了使生物指示剂验证得到阴性培养结果，灭菌F0应能使生物指示剂孢子含量下降至100后，再降低1个对数单位，即F0＝DBi(lgNBi-lgNF)=DBi(lgNBi+1)。

 

阴性分数法

 

计算生物指示剂的用量可以采用以下公式：

 

lgNBi=lgNt+F0/Dbi=2.303×lg(n/q)+F0/Dbii

 

备注：n为挑战试验瓶样品总数，q为挑战性试验结果为阴性的瓶数。当湿热灭菌工艺的灭菌温度和灭菌时间确定后，F0可以确定；生物指示剂确定后，Dbi可以确定；微生物挑战试验方案确定后，n、q可以确定。所以，通过以上的几个公式，可以计算出生物指示剂的用量，即N0。

 

07第七节 干热灭菌工艺开发

 

工艺开发的目的是为了确认关键和重要运行参数，这些参数能够保证装载满足灭菌/除热原的最低可接受标准。组成装载的物品必须在工艺开发前确定下来。腔体的热力学性质及物品和装载模式的热力学属性将在工艺开发过程中进行测定。灭菌工艺应能代表实际的生产条件（例如使用经过水喷淋的方式模拟清洗过的西林瓶），并且开发工艺的过程需要进行良好的记录。本节将以干热灭菌柜为例进行干热灭菌工艺的开发。

 

设计灭菌方法

 

用于灭菌/除热原工艺开发可分为干热灭菌（残存概率法）、干热灭菌（过度杀灭方法）、灭菌和除热原。三者都能够实现对物品灭菌或除热原以达到无菌保证或内毒素的降低水平。

 

干热灭菌（残存概率法）

 

残存概率法可以用在热不稳定物品的灭菌工艺开发。该工艺取决于测定物品携带微生物的数量及耐受性。一旦负荷微生物的耐热性和数量被界定就可以设计PNSU不大于10-6的灭菌程序。微生物负荷应进行定期监控；经风险评估确定监控频率。

 

干热灭菌（过度杀灭方法）

 

当被灭菌品的热稳定性强时往往采用此法，通常不需要检查污染菌的含量。验证时可以采用半程序法进行生物指示剂挑战试验。

 

灭茵和去热原

 

对于去热原工艺，过度杀灭法应证明装载最冷点内毒素水平能够下降至少3个log单位。使用该工艺开发方法时，必须要考虑灭菌物品存在热降解的可能性。

 

定义运行参数

 

干热灭菌/除热原过程的关键操作参数是温度和暴露时。另外要考虑的重要参数可能包括压差、加热和冷却阶段的时间、温度。运行参数的开发应确保灭菌工艺使用的挑战菌满足最低的PNSU达到至少10-6的水平，和/或除热原工艺实现内毒素下降至少3个log单位。装载应进行温度研究，以确认装载的最差条件。工艺开发研究结果必须在起始验证或确认运行中进行确证。

 

开发装载类型

 

最差条件的装载取决于装载种类，布局或其它参数。工艺参数应达到装载所要求的时间和温度条件。

 

对于每个装载配置，装载内部和周围应有充足的空间，保证对装载物的热穿透性和去除水分的有效性。应考虑包装材料的类型，保护物品防止其在灭菌/除热原（前/中/后阶段）受到污染。

 

物品太大而无法装上推车的应高于地面放置，确保空气流通。柜内小推车的位置应在装载形式中记录（如装载位置的方向）。应考虑装载位置对物品加热的影响。用于放置装载的托盘、架子、手推车的材料应不产生颗粒或降解。通过热穿透研究进行最差位置或者最难灭菌/除热原位置的确认。热穿透FH值可用于研究最难灭菌或除热原的区域。

 

热分布研究

 

装载物的热分布研究是为了确认工艺过程中热介质穿过装载物的温度分布情况。热分布研究可能与热穿透研究同时进行。热分布测试用温度探头不能接触装载物品或柜体硬件（例如推车，架子，托盘）。应有图片详细描述温度探头在每个装载中的位置。

 

在进行温度分布研究时，运行参数应记录，运行阶段的标准包括以下方面：

 

每个探头测得温度的最大差值

 

探头与探头之间测得温度的最大差值

 

探头测得温度与设定温度之间的最大差值。

 

热穿透研究

 

热穿透研究确认预期量的能量已传输到装载中的物料或物品表面。热穿透研究用温度探头应被放置在装载物中，计算每个探头的FH值，用于确认加热最慢的位置。这样的位置可代表最难灭菌/除热原的位置。

 

对于由不同热穿透特性的物品组成的装载，探头放置应能代表每一种物品类型。每一种研究的装载方式，其温度探头放置位置以及选择该位置的理由应当作记录。

 

计算分析装载内所有温度探头的FH值，确定热穿透研究过程的有效性。这些数据可为随后的性能确认研究提供冷点位置。如果BI/EI挑战研究与热穿透研究同时进行，灭菌率和/或内毒素降低水平应符合预定的接受标准。

 

08第八节 干热灭菌设备确认

 

干热灭菌设备确认

 

以下将以干热灭菌柜为例，对干热灭菌设备确认的重点项目作简要阐述。

 

运行确认---压差测试

 

干热灭菌柜内气流和温度分布情况受室内压差影响，最小压差的确定依照系统设计要求，腔体内与外部环境的压差应当经过确证。

 

运行确认---高效检漏测试

 

干热灭菌器的出风系统必须保证符合A级洁净空气的标准，因此应对其高效过滤器定期进行完整性测试（如PAO测试）。髙效过滤器本身可能被高温破坏产生悬浮粒子，同时在使用过程中升温和降温速度对高效过滤器的寿命亦有很大影响。

 

运行确认---尘埃粒子测试

 

尘埃粒子测试通常是在开启风机但不加热模式下操作，应当关注取样点到粒子计数器的导管长度和弯曲度。如果需要，测试也可在升温和冷却状态下进行，在高温状态下测试时，测试导管应连接热交换器，用来冷却进入粒子计数器的空气。

 

运行确认---空载热分布测试

 

空载条件下的温度分布研究是确认加热介质的均一性。测试用温度探头不应与腔室的内表面接触，至少在温度控制探头附近放置一个热分布探头。在测试期间，应当确定并记录运行的关键参数和重要参数。至少选择10个以上经过校正的测试探头，此试验应连续进行3次，以证明热分布的重现性。

 

性能确认---负载热分布及热穿透测试

 

负载热分布测试可反应负载情况下空气温度达到灭菌温度设定值所需要的时间，负载热穿透测试则反映灭菌对象达到灭菌温度时所需要的时间。显然，灭菌对象达到最低灭菌温度的时间将滞后于腔室内空气达到最低灭菌温度所用的时间，而滞后值在最大装载时最为明显。负载热分布及热穿透测试可同时进行。应连续运行3次，以证明灭菌/除热原过程具有重现性。

 

性能确认---微生物挑战测试

 

微生物挑战是通过使用生物指示剂或内毒素指示剂来确认对装载物品的灭菌/除热原效果。指示剂应放在装载物内的数个地方，包括除热原/灭菌效果最差的位点。微生物挑战测试可与热穿透测试同时进行。

 

对于干热灭菌，应证明挑战微生物在该过程中的存活概率不大于10-6。通常生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子，D值大于1.5min，含菌量5×105~5×106个。

 

对于除热原，一般将不小于1000单位的细菌内毒素加人待除热原的装载物，证明该除热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素。

 

由于除热原的工艺比杀灭袍子的灭菌工艺要苛刻得多，所以干热除热原工艺验证中实施内毒素挑战试验时，不必再进行生物指示剂挑战试验。

 

环境试验设备确认

 

环境试验设备主要指提供稳定温度和/或湿度环境的箱体类设备，一般为市售的非订制设备。包括但不仅限于以下设备：

 

干燥箱

 

培养箱

 

恒温恒湿箱

 

药用冰箱

 

水浴箱

 

环境试验设备确认要点如下：

 

校准检查

 

关键仪表、传感器应在运行确认前进行校准。校验范围应满足用户使用的范围。如药用冰箱实际使用范围是2~8℃，则校准范围应至少涵盖2~8℃。

 

功能确认

 

根据用户需求的操作范围，对操作参数的范围进行确认，而不能仅仅对典型的情况进行测试。

 

报警确认

 

如冰箱的高温或低温报警，恒温恒湿箱的温度/湿度超标报警。

 

权限确认

 

如果操作系统有登录权限的设定功能，应进行权限测试。不同级别的权限应在使用SOP中进行规定。

 

数据管理确认

 

如适用，数据的安全性、存储、备份、恢复审计追踪等功能应按照规定的程序进行测试。

 

温度/湿度分布确认

 

确认温度/湿度能够持续稳定在样品储存的要求范围内。一般进行空载测试，如需要，可进行负载测试。温度/湿度分布测试一般不低于24小时连续记录。