加标实验一般用于分析方法验证，计算回收率。其实，合成部门的工艺开发，也需要进行加标实验。

什么是加标实验？

向反应体系中故意加入某种物质，研究加入物质对反应的影响。

为什么要进行加标实验？

直接目的是研究加入物质对反应的影响。

根本目的是识别工艺的耐受性，制定合理的质量标准，保证工艺的重复性。

有机反应，溶剂的用量往往最大（neat反应除外），对水敏感的反应中加入催化量的水，考察水对反应的影响，有助于溶剂质量标准的制定，有时候试剂的含水量也要评估。

金属催化反应，体系中加入其他金属，有助于评估工艺放大过程，设备改变对反应的影响（设备材质的改变），保证工艺的重复性。

体系中加入某杂质，研究杂质的衍生情况和工艺去除杂质情况，验证工艺的耐受性，制定物料的合理标准。

什么阶段进行加标实验？

类似催化量水的加标，设备材料的加标等，一般在工艺优化中进行，边优化，边进行。

杂质的加标，一般在工艺参数基本确定后再进行，因为一旦工艺参数改变，原有加标数据可能就无效了。过早进行杂质加标实验，分析方法的可靠性也需要评估。

通常完成小试验证，根据小试验证批次杂质检出情况，进行合理的杂质加标。

如何进行加标实验？

单步反应研究多个杂质，如何加标？

多个杂质同时加到一个反应中进行，分开独立加标是不合理的，因为原料或中间体的杂质谱是多个杂质共存的。必须考虑多个杂质之间的相互影响。有时候，独立的杂质在多个杂质存在下，不一定会定向衍生。

如何零点取样？

反应前，将底物和加标的杂质，用溶剂溶解后取样作为零点，HPLC记录。

如果反应体系是悬浊液，最理想方式是把底物和加标的杂质用其他溶剂溶解后再浓缩去除溶剂，固体零点取样；如果悬浊液直接取样，为降低风险，多点取样，取平均值。

如果没有得到杂质标准品，但是得到了该杂质的衍生物，可以末端取样。具体操作：反应转化完成，分离前加入杂质衍生物，HPLC记录，对比分离前后杂质情况。

如何数据分析？

根据杂质衍生和去除情况，计算杂质去除因子，评估工艺去除杂质能力。

举例：杂质A加标到1.0%，处理后衍生杂质B检出0.05%。根据杂质去除因子，理论评估，杂质A 2.0%时，处理后衍生杂质B不会超过0.10%，这种去除杂质的评估不可取；反之可以。

切记：日常检样的相对面积百分比和去除因子不一定完全对应（考虑校正因子）。相关问题，见链接：

合成和分析之间那点事：去除因子和相对面积百分比

杂质加多少量合适？

这个没有标准，合理即可，数据能支撑质量标准就行。

小编认为，如果日常检出某杂质0.10%，根据对杂质的理解，加标到0.2-0.5%足以；加多了可能影响反应本身投料的转化。

加标实验过程，反应没有正常转化，杂质加标有效吗？

加标无效，如果没有操作误差，加标后，反应没有正常转化，说明加标物对反应有影响，没有评估好杂质对工艺的影响，需要重新加标进行评估。除非工艺放宽中控的限度。

没有杂质标准品，如何加标？

富集杂质，例如原料中某杂质0.12%，可以经重结晶富集到0.3%左右，用该批次原料进行反应投料，评估工艺对该杂质的耐受能力，制定原料的合理质量标准。