摘要: 《中国药典》2020 年版三部“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”( 通则 9401) 是国内首个适用于生物制品生物活性/效价测定方法验证的指导原则，弥补了国内缺少针对生物活性方法验证指导原则的空白。为正确理解和执行该指导原则，推动国内生物活性/效价测定方法验证工作的规范化，本文从该指导原则的新增背景、起草过程、国内外药典比较和主要内容解读等几方面进行了阐述，并对未来该通则内容的完善进行了初步展望，旨在为广大从业人员提供指导性建议及参考。

生物活性/效价是药品产生特定生物学效应的能力，是评价药品有效性最关键的质量指标。根据分析方法手段不同，生物活性/效价测定方法包括基于整体动物、离体组织、细胞和微生物等生物体的体内外生物活性测定法、免疫化学方法、酶反应试验、结合试验等。生物活性/效价测定主要可用于原液及成品的批放行、稳定性评价、标准品及其他关键试剂质量的确认、工艺中间体及处方制剂的表征、污染物及降解产物等杂质的表征，以及为产品生产工艺变更提供依据。

对生物活性或效价测定法进行充分的验证是保障其适用性的重要前提。《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》) 截止 2015 版的历版已收载了 30多种生物活性/效价测定方法( 通则 3500) ，但涉及生物活性/效价测定方法验证的相关技术指南均为空白。目前国际上可参考的相关技术指南和指导原则为数较少，且要求尚未统一，总体上以美国药典( USPNF 2021) 收载的“biological assay validation( 生物检定方法的验证)［1］( 通则 1033) ”内容最新且全面，该通则介绍了生物活性/效价测定方法的主要验证参数，强调了设立系统适用性要求的重要性，通过报告验证指标的置信区间控制实验误差大小，并建议耐用性应在方法开发阶段进行重点考察。此外，该通则还重点介绍了验证方案的制定、结果文件记录、验证设计、各验证参数的验证策略、验证可接受标准、方法维护及统计学考量等内容，对于研究建立我国“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”提供了很好的参考。

生物技术药物的快速发展使各种新的生物活性测定方法层出不穷，建立与之配套的分析方法验证指导原则以保障测定方法适用于检测目的，从而科学、准确的评价或控制产品的有效性成为产业和监管部门的迫切需要。在此背景下，国家药典委员会及时立项开展相关研究，由上海市食品药品检验研究院牵头，广东省药品检验所参与完成了《中国药典》2020 年版新增通则《生物活性/效价测定方法验证指导原则》( 通则 9401) 。本通则是在前期对比研究国内外各相关指南［2-19］的基础上，通过初步调研国外具有相关经验的制药企业，了解各企业在开展生物活性/效价测定方法验证时的实操情况及主要遵循的指导原则，以 ICHQ2 ( Ｒ1 )［2］为 原 则 导 向，USP ＜ 1033 ＞［1］为 内 容 蓝 本，启 动《中 国 药 典》( ChP) 相关技术指南( 通则 9101)［20］的起草工作，随后邀请国内 12 家企业开展了扩大验证。最终完成的技术指南( 通则 9401) 主要用于指导和规范新建活性/效价方法或因各种相关变更涉及活性/效价测定方法的改变时的验证工作。

1 现行国内外相关标准比较

本指导原则起草过程中综合考虑了 ICHQ2( Ｒ1)［2］、USP ＜ 1033 ＞［1］和 ChP ＜ 通则9101 ＞［20］相关原则以及企业实操情况和最新发展趋势，在适用范围、框架结构及涵盖内容方面与 USP ＜ 1033 ＞［1］相似，本指导原则提取了相关统计学术语与名词进行专门内容解释，而 USP ＜ 1033 ＞［1］对于相关术语和名词将是在各具体项下说明或指向其他通则。

在内容设置上，ChP ＜ 9401 ＞ 按照方法验证生命周期的理念，将“方法验证的基本要素”分为验证方案的制订、各验证指标的验证策略、验证结果的记录和方法的监控及再验证四个方面来有序阐述，与USP 所涵盖的相关内容在框架和内容分布及排序上有较大区别。ICHQ2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］适用范围及整体框架方面较 ＜9401＞ 区别较大，且均不包含验证实例。ICHQ2( Ｒ1)［2］适用范围更广，包括理化分析方法及生物测定法，框架上分为第一部分: “分析方法验证正文及术语”( 含前言、不同分析方法需验证的指标列表、术语) 及第二部分“分析方法验证: 方法学”( 含前言及各验证指标的验证策略) ; ChP ＜ 9101 ＞［20］主要针对理化分析方法，分为前言和各验证指标的验证策略两大部分。本指导原则与其他相关指南具体比较详见表 1。

2 通则主要内容解读

2. 1 验证方案

开展验证工作前首先需要制订详细的验证方案作为验证时的指导与依据。验证方案一般包括验证设计、验证指标与合理的可接受标准和数据分析计划等，同时要考虑到验证工作中可能会有失败的情形，应在验证方案中对不满足可接受标准时需采取的措施加以规定。

验证设计应重点考量检测过程中的可能对实验结果产生较大影响的因素，因此做验证设计时至少需考虑要考量哪些因素，比如分析人员、细胞代次、关键试剂、测定板、重复策略等; 还需考虑是采取嵌套设计还是析因设计或其他合适的实验设计模式，需要根据研究目的而定; 还有为了使验证指标符合预设的可接受标准，需考虑进行验证的样本量等。验证指标需要视具体方法拟订。可接受标准的制定应基于决策风险最小化的原则，即应尽量降低因方法变异而对测定结果作出误判结论的概率，根据测定方法特点和验证目的来确定。此外，应设置试验有效性的可接受标准即系统适用性要求以证明试验体系运行良好和保证实验结果的可靠性; 且由于相对效价测定属于对比检定，要求标准品和供试品的剂量反应曲线相似，因此还需设置样品结果有效性的可接受标准即样品适用性要求。

进行数据分析时，建议根据数据的实际分布情况来选择分析方法: 对于测得相对效价呈正态分布的，数据可不经转换直接进行处理; 对于大多数测得相对效价呈偏态分布的，需经对数转换为呈正态性分布的数据再处理。当无法满足上述统计学要求时，也可考虑釆用其他适宜的替代方法进行数据分析。

2. 2 各验证指标的验证策略

相对效价测定方法常用的验证指标包括专属性、准确度、精密度( 重复性、中间精密度、重现性) 、线性和范围，后 4 个指标的验证通常可进行合并设计。

2. 2. 1 专属性

专属性一般具有两层含义: 其一，在其他杂质、降解产物及基质等存在时，采用的测定方法不受这些成分的干扰能正确测定待测物的能力; 其二，可区分相关但不同的物质。通常考察专属性的实验设计是平行稀释的添加/不添加潜在干扰物的标准品同时进行试验，或直接取基质、产品相关产物或非相关物质与待测物同时进行试验; 另外，体现分析方法专属性的一个重要方面就是能指示产品的稳定性，因此也可通过加速破坏待测样品的方式来评价分析方法的专属性是否足够好。收载于 USP 医药法典( USP Medicines Compendium) 的利妥昔、曲妥珠、依那西普等单抗品种的生物活性验证报告中，均考察了测定方法是否能指示样品的稳定性，实验设计主要是将样品在不同条件下进行加速破坏，再考察方法是否能正确测定出待测物经破坏后的效价变化或与标准品剂量反应曲线的相似性是否有变化。

2. 2. 2 相对准确度 

关于准确度的评价，本指导原则与 USP＜1033＞［1］类似，但与 ICH Q2( Ｒ1)［2］及ChP ＜ 9101 ＞［20］均有区别。

首先，在名称上，ChP ＜9401＞ 和 USP ＜1033＞［1］均为“相对准确度”，而 ICH Q2 ( Ｒ1)［2］和 ChP ＜9101＞［20］均无“相 对”二 字，称为“准确度”。其次，在定义上，ChP ＜ 9401 ＞ 和 USP ＜ 1033 ＞［1］均指测得效价与已知效价接近的程度，其中测得效价与已知效价均为相对百分数，并非效价的绝对值，而ICH Q2( Ｒ1)［2］、ChP ＜ 9101 ＞［20］将准确度均定义为测量值与真实值或参考值接近的程度，测量值与参考值一般为绝对值。最后，在评价方法和评价指标上也有区别，在评价方法上，考虑到相对准确度与线

性指标合并考察，ChP ＜ 9401 ＞ 和 USP ＜ 1033 ＞［1］均推荐评估 5 个效价水平，每个水平至少独立测定3 次。而 ICH Q2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］建议评价同一浓度至少重复测定 6 次或至少评价 3 个浓度，每个浓度重复测定 3 次。在评价指标上，本指导原则提出可采用相对偏倚，也可采用其他适宜指标来表示，如回收率，这与 USP ＜ 1033 ＞［1］仅使用相对偏倚，而 ICH Q2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］仅使用回收率作为评价指标均有差别。这是因为相对偏倚与回收率是可以相互转换的两个数学概念，评价意义相同，经企业调研，回收率与相对偏倚相比，也更为大家熟知。因此，实际验证中选用相对偏倚或回收率作为评价指标均可。

值得一提的是，在相对偏倚置信区间的报告上，考虑到目前国内企业报告该指标的普及性较低，故对其报告未作硬性要求，但仍在 ChP ＜ 9401 ＞ 中列出了相对偏倚置信区间的计算公式以作参考。目前国外标准包括 USP ＜ 1033 ＞［1］和 ICH Q2( Ｒ1)［2］对置信区间的报告均有要求。报告置信区间对评价验证数据质量具有重要意义，目前国内外普遍做法是将获得的验证指标点估计值直接与其可接受标准相比，若在预设的标准范围内，则认为结果符合要求，实际上该做法风险较大。因为每个方法都有测量误差，而某次实验测得的相对偏倚点估计值是否接近真值未能确定，实验所得数据质量如何无法靠点估计值去判断，而需要通过点估计值的置信区间来判断实验误差大小是否在可接受范围内，从而减少误判风险。

2. 2. 3 精密度 

与理化分析方法不同，相对效价测定方法通常实验操作需要好几天，还涉及到使用不同的检测板，同一块检测板内对同一份供试品也会设置几份独立的重复，这样在考察中间精密度时( 不同时间、不同检测板、不同检测仪器、不同操作人员、不同批号试剂等) 也涵盖了重复性的考察。考虑到国家药品质量标准采用的分析方法均应进行重现性验证，故验证指标仍涵盖重复性、中间精密度和重现性三项，但具体的评价方法仅介绍了中间精密度的评价。

在评价指标上，鉴于使用的普及性及相对效价测定值大多数呈对数正态分布，选用几何标准偏差( GSD) 和几何变异系数( GCV) 代替标准差( SD) 和相对标准偏差( ＲSD) 进行评价。与相对准确度类似，本指导原则虽未对报告精密度的置信上限作硬性要求，但该指标对反映精密度数据质量的意义也不容小觑。此外，对于具备一定统计基础的实验室也可选用方差分析法进行精密度的评价，USP ＜1033 ＞［1］中介绍了中间精密度评价的方差分量分析法，系将中间精密度的方差分解为试验内变异和试验间变异，这样可便于找出造成实验结果变异的主要来源。但该方法对实验人员统计学知识要求较高，推广普及难度目前较大。

2. 2. 4 线性及范围 

与常规线性范围考察不同，本指导原则提出了稀释线性的概念，系根据相对准确度的实验设计进行稀释线性考察，评价方法可参考相对准确度。

特别要指出的是，范围作为测定方法能达到一定准确度、精密度和线性要求时的“量的区间”，在不同分析方法中指代有所不同。在使用外标法、内标法或标曲代入法进行数据处理的理化分析方法中，该“量的区间”常指能符合要求时的剂量区间或浓度区间; 而对于使用量平行线测定法或四参数回归计算法进行数据处理的相对效价测定法，则指稀释线性、中间精密度和相对准确度符合要求时，可测定的效价水平剂量范围变化的区间，即效价水平变化的区间。但两种情况下，范围都需覆盖质量标准中含量或效价限度范围。

2. 2. 5 其他验证指标的考虑 

本指导原则验证指标未涉及耐用性。由于进行耐用性考察的目的主要是为了确定重要的实验参数及最优范围，以确定系统适用性要求，因而建议在测定方法开发阶段或预验证阶段进行考察［1，2］，以确保验证工作的顺利进行。这与 ChP ＜ 9101 ＞［20］在方法验证阶段进行耐用性的考察有很大不同。

耐用性考察常采用全因子设计，系将待考察的因素，如细胞密度、细胞代次和药物作用时间等设置两个变化水平及一个中心点条件，分不同时间重复试验，而后采用统计学方法进行数据分析，最后确定各条件的耐用范围。

2. 3 验证结果的记录及方法的监控及再验证

验证结果应当正确、合理、规范地记录，形成验证报告。此外，经验证的方法投入日常使用后，其性能是否同验证时一样能满足要求需选择合适的统计方法进行持续地监控; 并明确需要再验证的情况，必要时可开展再验证工作。

2. 4 方法验证实例

生物制品有多种相对效价测定方法，目前收载于 ChP2020 最常用的方法有基于细胞和酶联免疫吸附法( ELISA) 的体外活性测定法及基于动物的体内活性测定法。为考察本指导原则验证要求的合理性和可行性，对不同品种进行了扩大验证工作。为便于理解，同时增加本指导原则的可参考性，选择扩大验证中的体外法( 细胞法) 和体内法( 动物法) 各一例作为验证实例来演示验证设计、分析步骤和计算过程。以细胞法为例，验证中将相对准确度、精密度、线性及范围 4 个指标进行合并实验设计，同时考察不同时间、不同分析人员和细胞代次 3 个因素对实验结果的影响，每个因素两个变化水平，采用三因素两水平的全因子设计，共进行 8 轮试验。每轮试验中考察了在对数尺度上从 0. 5 至 2 呈均匀间隔的5 个效价水平，每个效价水平在一块板内设置两个独立重复，以两个独立重复的平均值出具一个报告值。如此每个效价水平在 8 轮实验中可获得 16 个测定值，8 个报告值，最终共获得 5 个效价水平的 80个测定值，40 个报告值。而后用该 40 个报告值合并计算来评价准确度、精密度、线性和范围，其中准确度与线性又可通过线性回归来合并考察。动物法考虑到实验成本及实验动物个体差异太大，不同效价水平的效应差异不如体外法明显，故动物法中实验设计及评价方式略有不同。

3 结语与展望

《中国药典》2020 年版新增“生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则”( 通则 9401) 充分借鉴了国际先进标准，引入了方法验证生命周期的理念，在验证中，从方案的制订，各验证指标的考量，验证结果的记录到方法的再验证等方面，对方法验证的全过程进行了阐述。同时也结合国内企业实际调研情况进行了部分调整，增加了实例，提高了可操作性，可作为参考性文件指导开展验证工作。但需要说明的是，本指导原则拟订验证方案时没有固定统一的模板，需根据具体品种具体方法选择不同的实验设计，重点考量易引起实验结果变异的影响因素。此外，建议各单位在开展验证工作之前，对建立的方法进行充分的耐用性研究以保证验证工作的顺利开展，而且根据分析方法的特性及用途，在产品开发阶段和生产阶段决定分析方法需验证的程度。

作为《中国药典》上次收载的适用于生物制品生物活性/效价测定方法验证的指导原则，未来将随着相关技术发展进一步完善，包括细化各项验证指标可接受标准的制订原则，探究部分验证指标的评价方法，以及探讨分析方法经验证后如何评估再验证的需求和确定再验证的程度，以满足生物药研发和产品质控的需要，并实现与国际标准的全面接轨。